(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202211299401.2 (22)申请日 2022.10.23 (71)申请人 吉林大学 地址 130012 吉林省长 春市长春高新技术 产业开发区前进大街269 9号 (72)发明人 吴玉清　李洪伟　张岩　 (74)专利代理 机构 长春吉大专利代理有限责任 公司 22201 专利代理师 刘世纯　王恩远 (51)Int.Cl. C09K 11/02(2006.01) C09K 11/58(2006.01) B82Y 20/00(2011.01) C07K 14/245(2006.01) C07K 1/107(2006.01)C12N 9/14(2006.01) B22F 1/102(2022.01) B22F 1/054(2022.01) B82Y 30/00(2011.01) B82Y 40/00(2011.01) G01N 21/64(2006.01) (54)发明名称 一种基于伴侣蛋白GroEL保护的荧光金纳米 簇、 制备方法及其应用 (57)摘要 一种基于伴侣蛋白GroEL保护的荧光金纳米 簇、 制备方法及其在GroEL抑制剂筛选中的应用， 属于荧光探针技术领域。 该荧光探针是以三水合 氯金酸(HAuCl4·3H2O)作为Au源， GroEL蛋白作 为还原剂和最终的配体稳定剂， 利用GroEL蛋白 制备荧光金纳米簇此前从未报道过， 实验证明该 荧光金纳米簇具有良好的荧光稳定性； 而且， 基 于伴侣蛋白GroEL保护的荧光金纳米簇的GroEL 蛋白基本保留了原有的二级结构， 并在类ATP酶 (ATPase‑like)的活性测试中表现出未丧失原有 的活性。 因此， 可基于保留完好的蛋白结构和功 能， 利用AuNCs @GroEL良好的发光性能用于GroEL 抑制剂的筛 选。 权利要求书1页 说明书6页 附图4页 CN 115491191 A 2022.12.20 CN 115491191 A 1.一种基于伴侣蛋白GroEL保护的荧光金纳米簇， 其特征在于： 是在100 μLGroEL溶液中 加入HAuCl4水溶液， 充分混匀， GroEL与HAuCl4的用量摩尔比为10～15： 6； 然后加入20 μL、 1M 的NaOH水溶液， 充分混匀， GroEL蛋白解聚变性产生氨基酸将HAuCl4中的金离子还原成金原 子； 再在50～70℃下反应1.5～3.0h， 反应结束后用10kDa的透析袋于pH＝7.4的1 ×PBS中透 析24h使蛋白复性， 袋内液即为基于伴侣蛋白GroEL保护的荧 光金纳米簇溶 液。 2.如权利要求1所述的一种基于伴侣蛋白GroEL保护的荧光金纳米簇， 其特征在于： 首 先取含有GroEL与RDPV质粒的大肠杆菌1～3mL， 加入到含有50 μg/mL卡那霉素与20 μg/mL氯 霉素双抗的100mL  LB培养基中， 37℃、 220r/min过夜， 再将其以1： 200的体积比例接种于含 上述双抗的1L  LB培养基中， 同时加入2g/LL ‑阿拉伯糖诱导菌体表达RDPV及GroEL， 37℃、 220r/min直到其 OD600值达到0.6～ 0.8， 再加入100 μL、 1mol/L  IPTG， 37℃、 220r/min诱导表 达14～16h； 诱导表达后的菌种通过3000～5000r/min、 25～30min离心进行收菌， 然后加入8 ～12mL、 pH7.4的PBS重悬于50mL离心管中； 将得到的菌液按1： 10的体积比加入裂菌液进行 超声破碎， 超声5s， 间歇5s， 超声有效时间为25～35min， 超声破碎后于16000r/min离心20～ 30min， 取上清液， 加入饱和硫酸铵溶液， 使上清液中硫酸铵的质量终浓度为30％； 4℃搅拌 1h， 10000r/min离心25～35min， 分离上清及沉淀， 将沉淀用PBS等体积重悬， 得到30％硫酸 铵沉淀复溶样品； 再在蔗糖密度梯度离心管中依次缓慢加入质量分数60％、 50％、 40％及 30％的蔗糖溶液， 每梯度2mL； 取30％硫酸铵沉淀复溶样 品加满离心管， 配平后置于超速离 心中， 4℃、 35000～40000r/min离心4h； 将离心管上层GroEL溶液吸出， PBS透析除去蔗糖后 利用AKTA纯化蛋白， 得到纯化后的GroEL溶 液。 3.如权利要求1所述的一种基于伴侣蛋白GroEL保护的荧光金纳米簇， 其特征在于： GroEL与HAuCl4的用量摩尔比为1 1： 6。 4.权利要求1～3任何一项所述的一种基于伴侣蛋白GroEL保护的荧光金纳米簇在 GroEL抑制剂筛 选中的应用。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115491191 A 2一种基于伴侣蛋白GroEL保护的荧光金纳米簇、 制备方 法及其 应用 技术领域 [0001]本发明属于荧光探针技术领域， 具体涉及一种基于伴侣蛋白GroEL保护的荧光金 纳米簇、 制备 方法及其在GroEL抑制剂筛 选中的应用。 背景技术 [0002]GroEL是一种来源于大肠杆菌的蛋白质， 由两个堆叠的七聚环亚基组成桶状结构， 每个亚基大小为57kDa， 它对新合成肽链的折叠和组装具有重要的辅助作用[1]。 众所周知， 天然正确 折叠形成的蛋白质对生物体行使其正常的生理功 能具有重要作用； 然而， 错误折 叠的蛋白质(即非天然多肽)容易引起蛋白质聚集而失能， 甚至导致危害。 Gr oEL可与共伴侣 分子GroES(70kDa的同型七聚体)协同作用， 以ATP依赖的方式将暴露在疏水区域的非天然 多肽转移至具有 疏水残基的Gr oEL空腔内； 随后， ATP水解导致底物释放能量， 辅助新生肽链 正确折叠[2]。 因此， Gr oEL和GroES对细菌体内蛋白质的正确折叠、 最终保障其行使正常功能 具有重要作用。 此外， 由于所有细菌中都含有至少一种(在所有 条件下都必不可少的)GroEL 同源物， 所以Gr oEL对细菌的生长也至关重要。 因此， 开发靶向Gr oEL的抑制剂则可作为一种 重要且具有广谱适用性的抗菌手段， 能有效避免抗生素导致的耐药菌的产生。 然而， 目前对 GroEL抑制剂的相关研 究还处于初级阶段， 筛选GroEL有效抑制剂具有重要的研究意义[3]。 再则， GroEL因其特殊的笼状结构以及ATP利用机制还可作为疏水性药物的运输机器， 据报 道GroEL可作为肿瘤药物的天然靶向载体[4]。 因此， 开发带有荧光标签的GroEL对研究其作 用机制、 发挥其功能， 以及进一 步拓展其应用均具有重要的科 学意义。 [0003]具有较小尺寸(≤2.2纳米)的金属纳米簇(NCs)在受到适当配体保护时可发出荧 光。 相比于传统的荧光 染料， 蛋白质中的部 分氨基酸(络氨酸、 半胱氨酸等)残基可以作为金 属离子的还原剂， 允许形成稳定的、 蛋白保护的金属纳米簇； 而且， 由于NCs的尺寸较小， 一 般不会明显改变蛋白质原有的二级结构和生物功能[5]。 作为细菌生长的重要蛋白， Gr oEL蛋 白序列上含有的络氨酸和半胱氨酸(Cys)残基可作为还原剂将氯金酸还原成金原子， 并以 保护配体的形式将其稳定， 因此可用来制备具有荧光效应的金纳米簇。 利用生物大分子蛋 白质合成的荧 光NCs具有安全性高、 生物相容 性好、 以及稳定性高等特点。 [0004]此外， 将GroEL与病毒衣壳蛋白在大肠杆菌中共表达可以提高目标蛋白的可溶性 表达， 进而在离心纯化后使其可以大量分布在上清溶液中， 有效提高目标蛋白的表达和纯 化效率。 然而， 与目标蛋白分离后的GroEL蛋白常被视为已完成使命的废弃物而被丢弃， 造 成浪费。 本发明利用这些废弃的GroEL蛋白来制备荧光金属钠米簇， 不但基于废物利用提供 了一种新型荧光材料AuNCs@Gr oEL， 尤其是可以以此为荧光探针来揭示GroEL与其它蛋白质 相互作用， 并可基于所含AuNCs的荧光变化来筛选Gr oEL抑制剂， 对深入揭示Gr oEL功能和作 用机制将具有非常重要的科 学意义。说　明　书 1/6 页 3 CN 115491191 A 3