(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202211209680.9 (22)申请日 2022.09.30 (71)申请人 天津医科 大学 地址 300000 天津市和平区气象台路2 2号 (72)发明人 杨红　甘颖　黄显　马惠强　 周明行　 (74)专利代理 机构 天津英扬昊睿专利代理事务 所(普通合伙) 12227 专利代理师 吴扬　李福新 (51)Int.Cl. B01L 3/00(2006.01) C12Q 1/6837(2018.01) B82Y 15/00(2011.01) B82Y 40/00(2011.01) (54)发明名称 用于miRNA 检测的金纳米花微阵列芯片的制 备及检测方法 (57)摘要 本发明公开了一种简单、 超灵敏的用于 miRNA检测的金纳米花微电极阵列芯片， 该芯片 采用了一种纳米银信号探针与金纳米花微电极 相结合的检测方法， 对miRNA进行高通量、 直接的 电化学分析。 通过两步杂交设计检测miRNA： 首先 miRNA与茎环探针杂交， 打开的茎环将进一步与 纳米银信号探针杂交以进行信号放大。 以miR ‑21 作为检测对象， 本发明金纳米花微阵列芯片显示 出对miR‑21检测的优异性能， 检测限为0.56fM， 线性范围为1fM到10pM。 本发明金纳米花微电极 阵列芯片在区分3碱基错配靶序列方面也表现出 良好的特异性， 并且能够直接检测出肺癌细胞和 正常细胞裂解物中miR ‑21的表达差异， 在癌症即 时检测方面显示出巨大的应用前 景。 权利要求书2页 说明书5页 附图3页 CN 115518701 A 2022.12.27 CN 115518701 A 1.一种用于miRNA检测的金纳米花微阵列芯片的制备方法， 其特征在于， 该方法包括以 下步骤： (1)加工微阵列芯片； (2)在微阵列芯片的微 孔中电沉积金纳米花 微电极； (3)对步骤(2)加工 完毕的微阵列芯片中的金纳米花 微电极进行表面功能化。 2.按照权利要求1所述的一种用于miRNA检测的金纳米花微阵列芯片的制备方法， 其特 征在于所述加工微阵列芯片具体包括以下子步骤： (1.1)选用玻璃作为基底， 经 过RCA标准清洗 工艺清洗并烘干； (1.2)在基底上依次溅射Cr粘附层、 金电极层， 金电极层的厚度为20 0nm； (1.3)通过光刻法刻蚀出 金传感区域、 焊 盘及导线； (1.4)使用气相沉积技 术沉积聚对二甲苯绝 缘层； (1.5)通过光刻法和反应离 子刻蚀技 术得到微 孔金电极(10 μm)； (1.6)使用玻璃刀将芯片进行切割， 得到微阵列芯片单 元。 3.按照权利要求1所述的一种用于miRNA检测的金纳米花微阵列芯片的制备方法， 其特 征在于所述金纳米花微阵列芯片由玻璃、 Cr粘附层、 金电极层、 聚对二甲苯绝缘层、 金纳米 花微电极组成， 所述玻璃上侧依次溅射有Cr粘附层、 金电极层， 所述Cr粘附层、 金电极层上 侧沉积有聚对二甲苯绝缘层， 所述聚对二甲苯绝缘层形成的微孔中沉积有金纳米花微电 极。 4.按照权利要求1所述的一种用于miRNA检测的金纳米花微阵列芯片的制备方法， 其特 征在于所述在微阵列芯片的微 孔中电沉积金纳米花 微电极具体包括以下子步骤： (2.1)将微阵列芯片依次用丙酮、 异丙醇和水清洗1分钟并用氮气吹干 。 (2.2)利用恒电压法在电镀液(50mM  HAuCl4和0.5M HCl)中进行金纳米花结构电极电沉 积。 沉积电压为0.5V， 沉积时间为20 0s。 5.按照权利要求1所述的一种用于miRNA检测的金纳米花微阵列芯片的制备方法， 其特 征在于所述金纳米花 微电极的表面功能化具体包括以下子步骤： (3.1)将5μM茎环探针(5 ’ ‑HS‑C6‑GGCCGTCAACATCAGTCTGATAAGCTAAACATGATGACGGCC ‑ 3’)溶液(含有1M  NaCl和10mM  Tris‑HCl)置于95℃ 水浴锅中加热10min然后缓慢冷却到室 温， 得到折叠好的茎环探针； (3.2)将5 μL茎环探针溶 液滴在金纳米花结构微阵列芯片上并孵 育过夜。 (3.3)用10mM  PBS彻底冲洗金纳米花 微阵列芯片以除去 多余的茎环探针； (3.4)通过将M CH溶液用10mM  PBS溶液稀释至10 0 μM， 得到 MCH封闭液； (3.5)将10 μL  MCH封闭溶液滴加到芯片表面以封闭金纳米花电极表面空余 位点； (3.6)用10mM  PBS彻底冲洗金纳米花微阵列芯片以除去多余 的MCH， 得到用于miRNA检 测的金纳米花 微阵列芯片。 6.按照权利要求1所述的一种用于miRNA检测的金纳米花微阵列芯片的制备方法， 其特 征在于该芯片检测miRNA的方法包括以下步骤： 选用miR‑21作为检测对象， 制备不同浓度的miR ‑21溶液(含有10mM  PBS,1M NaCl， 40mM   MgCl2)， 取200 μL滴加到金纳 米花微阵列芯片上， 在37℃下进行茎环探针与miR ‑21之间的碱 基互补配对， 1h后， 用10mM  PBS进行清洗， 再加入纳米银信号探针(5 μL， 1nM)25℃下孵育1h权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 115518701 A 2以结合被 miR‑21打开的茎环探针。 对用10mM  PBS清洗后的金纳米花微阵列芯片进行电化学 循环伏安法扫描并绘制miR ‑21浓度与循环 伏安曲线氧化峰电流的对应关系曲线。 7.根据权利要求6所述的一种miRNA检测的金纳米花微阵列芯片的制备方法， 其特征在 于， 纳米银信号探针的制备 具体包括以下子步骤： (a)纳米银制备： 在搅拌(700rpm)条件下煮沸柠檬酸三钠(5mM)和单宁酸(0.01mM)溶液 的混合物(50mL)。 然后向其中加入AgNO3溶液(500μL， 25mM)继续煮沸15min得到纳米银溶 液。 (b)将纳米银(500 μL， 1nM)与单链DNA(5 μL,100 μM)(HS ‑C6‑TTTTTGGCCGTCA)混合， 并在 0.1M NaCl存在下孵育48h。 离心清洗单链DNA修饰的纳米银两次(12000rpm， 10min)得到纳 米银信号探针。 8.根据权利要求6所述的一种miRNA检测的金纳米花微阵列芯片的制备方法， 其特征在 于， 将金纳米花微阵列芯片作为工作电极、 外接参考电极(Ag/AgCl电极)、 外接对电极(Pt电 极)插入到电化学池中， 以0.3 M KCl作为底液进行电化学循环 伏安扫描。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 115518701 A 3