(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202211207857.1 (22)申请日 2022.09.30 (71)申请人 四川大学 地址 610000 四川省成 都市一环路南 一段 24号 (72)发明人 郭俊凌　龚贵东　金鑫　何云翔　 (74)专利代理 机构 成都其知创新专利代理事务 所(普通合伙) 51326 专利代理师 房立普 (51)Int.Cl. C12N 15/10(2006.01) C12N 15/11(2006.01) B82Y 5/00(2011.01) B82Y 30/00(2011.01) B82Y 40/00(2011.01) (54)发明名称 保护功能核酸免受核酸酶降解和非特异性 结合蛋白干扰的纳米包裹材料的制备方法及应 用 (57)摘要 本发明公开了保护功能核酸免受核酸酶降 解和非特异性蛋白干扰的纳米包裹材料的制备 方法及应用， 包括以下步骤： 步骤1： 将纳米核酸 颗粒分散于溶剂中， 加入植物多酚充分混合均 匀； 步骤2： 在步骤1得到的溶液中加入多酚结合 剂充分混合均匀； 其中多酚结合剂为以下物质中 的一种金属盐、 蛋白酶、 金属盐和蛋白酶以任意 比例混合构成； 步骤3： 调节pH为中性， 高速离心 后弃上清， 加入溶剂超声分散； 即可得到包裹核 酸的多酚基纳米涂层； 本发明得到的薄膜可以通 过吸附Nuclesase和SSB， 或者降解Nuclease和 SSB来防止这些酶对功能核酸的破坏。 权利要求书1页 说明书6页 附图4页 CN 115521933 A 2022.12.27 CN 115521933 A 1.一种保护功能核酸免受核酸酶降解和非特异性结合蛋白干扰的纳米包裹材料的制 备方法， 其特 征在于， 包括以下步骤： 步骤1： 将纳米核酸颗粒分散 于溶剂中， 加入植物多酚充分 混合均匀； 步骤2： 在步骤1得到的溶液中加入多酚结合剂充分混合均匀； 其中多酚结合剂为以下 物质中的一种金属盐、 蛋白酶、 金属盐和蛋白酶以任意比例混合构成； 其中植物多酚与金属 盐的质量比为1:10～10:1， 植物多酚与蛋白酶的质量比为1:10～10:1， 植物多酚、 金属盐和 蛋白酶的质量比为1～10： 10～1:1～10； 步骤3： 调 节pH为中性， 高速离心后弃上清， 加入溶剂超声分散； 即可得到包裹核酸的多 酚基纳米涂层。 2.根据权利要求1所述的一种保护功能核酸免受核酸酶降解和非特异性结合蛋白干扰 的纳米包裹材料的制备方法， 其特征在于， 所述植物多酚为单宁酸、 没食子儿茶素没食子酸 酯、 多巴胺及衍 生物中的一种或两种以上以任意比例混合构成的混合物。 3.根据权利要求1所述的一种保护功能核酸免受核酸酶降解和非特异性结合蛋白干扰 的纳米包裹材料的制备方法， 其特征在于， 所述金属盐为Al、 Fe、 Zn、 Mn、 Ni、 Co、 V、 Ca、 Mg、 Cu 盐中的一种或两种以上以任意比例混合构成。 4.根据权利要求1所述的一种保护功能核酸免受核酸酶降解和非特异性结合蛋白干扰 的纳米包裹材料的制备方法， 其特征在于， 所述蛋白为胃蛋白酶、 胰蛋白酶、 组织蛋白酶、 木 瓜蛋白酶和枯 草杆菌蛋白酶中的一种或两种以上以任意比例混合构成。 5.根据权利要求1所述的一种保护功能核酸免受核酸酶降解和非特异性结合蛋白干扰 的纳米包裹材料 的制备方法， 其特征在于， 所述纳米核酸颗粒为核酸与金纳米颗粒连接形 成的球形纳米颗粒。 6.根据权利要求5所述的一种保护功能核酸免受核酸酶降解和非特异性结合蛋白干扰 的纳米包裹材 料的制备 方法， 其特 征在于， 所述纳米核酸颗粒制备 过程如下： 步骤1： 核酸序列为HS ‑TTT TTT TCA CTA TrAG GAA GAG ATG‑FAM的核酸， 通过巯基与 金纳米颗粒 连接； 步骤2： 以下两个序列的核酸结合： GA GAT GAT CGA ATA GTC TGA CTA CAA CT； HS‑(T)42 AGA CTA TTC GAT CAT CTC TTC TCC GAG CCG GTC GAA ATA GTG A； 步骤3： 步骤2中的核酸序列和步骤1中的金纳米颗粒通过金 ‑硫键结合， 即可得到纳米 核酸颗粒。 7.如权利要求1～6所述任一种制备方法得到的纳米包裹材料的应用， 其特征在于， 所 述多酚基纳米涂层用于保护内部核酸免受核酸酶和非特异性结合蛋白干扰。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115521933 A 2保护功能核酸 免受核酸酶降解和非特异性结 合蛋白干扰的纳 米包裹材料的制备方 法及应用 技术领域 [0001]本发明涉及核酸保护技术领域， 具体涉及 一种保护功能核酸免受核酸酶降解和非 特异性结合蛋白干扰的纳米包裹材 料的制备 方法及应用。 背景技术 [0002]核酸是脱氧核糖核酸D NA和核糖核酸RNA的总称， 是由许多核苷酸单体聚合成的生 物大分子化合物， 为生命的最基本物质之一。 核酸在生物医药领域有较多应用场景。 如基于 碱基配对和亲和相互作用的敏感分子识别能力， 功 能性核酸已被证明是一种多功能平台。 衍生于FNA的材料在细胞成像， 疾病诊断和癌症治疗等领域发挥着关键作用。 如代表性的 RNA切割DNA酶是一类单链DNA分子， 利用金属离子作为辅因子后具有催 化活性， 可以切割特 定序列的DNA或者RNA。 DNA酶已被作为检测活细胞中的微小RNA， ATP和金属离子等。 然而不 管在什么具体 应用场景中， 核酸都存在被核酸酶降解以及被单链结合蛋白结合的问题。 [0003]改变核酸结构， 如将核酸制 备成具有球型结构的材料， 这种设计能更好对的帮助 核酸分子抵抗核酸酶的降解， 其主要原理是球型核酸设计使得球体整体上带负电荷， 而负 电荷的核酸球体会在生理环境中 吸附大量正电荷的阳离子物质， 这些阳离子能很好的抑制 核酸酶的活性， 从而在一定程度上防止核酸降解。 这种 结构高浓度盐只能在一定程度上抑 制核酸酶的活性， 并不能完全使其失活， 仍有较大部分核酸会被降解。 另外， 球型核酸设计 不能防止单链结合蛋白对单链核酸的结合。 将核酸分子包裹于具有密集孔的材料中， 这种 方法主要通过物理方式将核酸酶或单链结合蛋白相分隔， 从而使得核酸被保护。 包括利用 共价有机框架， 金属有机框架或者核酸框架材料对核酸进行包裹。 单链结合蛋白和核酸酶 的尺寸非常小， 在技术上， 需要防止7纳米的蛋白是十分困难的， 不仅要求包裹材料的孔径 极小， 而且均匀， 这在材 料的制备 上很难实现。 [0004]现有的核酸定位方法为在核酸末端修饰有荧光分子， 通过共价修饰核酸分子， 实 现核酸分子与荧光物质的结合， 这一操作是十分复杂的， 核酸分子很容易在共价修饰过程 中被破坏。 将核酸设计为球型或通过化学修饰核酸以提高核酸的稳定性， 这种 方法制备 的 核酸被细胞胞吞后不能通过溶酶体。 提供额外的金属离子如二价铜离子、 二价锌离子以辅 助相应的DNA酶识别目标micr oRNA， 这种额外提供金属离子的方法不能与DNA酶实现精确共 定位， 增加了额外的操作， 游离金属离 子的毒性较大。 发明内容 [0005]本发明针对现有技术存在的问题提供一种具有核酸酶和单链结合蛋白吸附或灭 火功能的植物多酚基保护功 能核酸免受核酸酶降解和非特异性结合蛋白干扰的纳米包裹 材料的制备 方法及应用。 [0006]本发明采用的技 术方案是： [0007]一种保护功能核酸免受核酸酶降解和非特异性结合蛋白干扰的纳米包裹材料的说　明　书 1/6 页 3 CN 115521933 A 3