(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202211267416.0 (22)申请日 2022.10.17 (71)申请人 厦门大学 地址 361005 福建省厦门市思明区思明南 路422号 (72)发明人 梁逸云　高丰光　 (74)专利代理 机构 厦门南强之 路专利事务所 (普通合伙) 35200 专利代理师 马应森 (51)Int.Cl. C12N 5/077(2010.01) A61K 35/28(2015.01) A61P 35/00(2006.01) (54)发明名称 33位点单泛素分子增强骨髓前体细胞免疫 功能的方法 (57)摘要 33位点单泛素分子增强骨髓前体细胞免疫 功能的方法， 涉及基因工程技术领域。 从小鼠骨 髓中分离 得到骨髓前体细胞BMPCs(Bone  Marrow  Precursor  Cells)， 用33位点单泛素分子预处理 骨髓前体细胞， 再进行体外过继免疫， 最后进行 酶联免疫斑点实验和流式细胞技术实验。 实验证 明， 处理后的骨髓前体细胞的免疫功能明显增 强， 其抗原特异性CTL诱生能力也增强， 其杀伤肿 瘤细胞能力增强； 33位点单泛素分子可增加骨髓 前体细胞转输受体内淋巴细胞产生穿孔素、 颗粒 酶B的能力。 33位点单泛素分子增强的骨髓前体 细胞可在制备肿瘤免疫药物中应用。 权利要求书1页 说明书5页 附图2页 CN 115466721 A 2022.12.13 CN 115466721 A 1.33位点单泛素分子增强骨髓前体细胞免疫功能的方法， 其特 征在于包括以下步骤： 1)从小鼠骨髓中分离得到骨髓前体细胞； 2)用33位点单泛素分子预处 理骨髓前体细胞， 进行体外过继免疫。 2.如权利要求1所述33位点单泛素分子增强骨髓前体细胞免疫功能的方法， 其特征在 于在步骤1)中， 所述从小鼠骨髓 中分离得到骨髓前体细胞的具体方法为： 颈椎脱臼法处死 小鼠， 75％酒精消毒10min后， 无菌分离其肱骨、 股骨和胫骨， 以5mL无菌注射器将骨髓尽可 能完全冲出， 再以1mL无菌注 射器底部充分研磨骨髓成单细胞悬液； 1500rpm  5min离心弃上 清后， 加入2mL红细胞裂解液ACK裂解红细胞4～5min， 再加入2mL完全培养液终止； 再次离 心、 弃上清， 加入细胞因子IL4和GM ‑CSF， 使其终浓度为1ng/mL和10ng/mL； 置于37℃， 5％CO2 恒温培养箱中培养； 在第4～5天时， 弃去上清中悬浮细胞， 以PBS冲洗皿底， 得到的皿底贴壁 的细胞即为从小鼠骨髓中分离得到的骨髓前体细胞BMPCs。 3.如权利要求1所述33位点单泛素分子增强骨髓前体细胞免疫功能的方法， 其特征在 于在步骤2)中， 所述用33位点单泛素分子预处理骨髓前体细胞， 进行体外过继免疫的具体 步骤为： 将步骤1)分离得到的骨髓前体细胞先加入泛 素突变链K33  Only， 作用后， 负载外源 性抗原OVA， 收集细胞至离心管中， 以PBS 重悬细胞并离心去除多余杂质影响； 再以预温的生 理盐水或PBS重悬细胞调整其浓度， 经腹腔将相同数量的骨髓前体细胞转输到相同基因背 景的4～6周龄 C57BL/6雌性小鼠体内； 5～7天后取其脾脏、 淋巴结研磨， 制成细胞 悬液备用。 4.如权利要求3所述33位点单泛素分子增强骨髓前体细胞免疫功能的方法， 其特征在 于加入泛素突变链K33  Only 5～7.5 μM， 作用30min， 负载外源性抗原OVA  50 μg/mL， 4h后， 收 集细胞至 离心管中。 5.如权利要求4所述33位点单泛素分子增强骨髓前体细胞免疫功能的方法， 其特征在 于加入泛素突变链K3 3 Only 5 μM。 6.如权利要求3所述33位点单泛素分子增强骨髓前体细胞免疫功能的方法， 其特征在 于预温的生理盐水的温度为37℃。 7.如权利要求3所述33位点单泛素分子增强骨髓前体细胞免疫功能的方法， 其特征在 于所述泛素突变链K33  Only只在K33位点保持赖氨酸不变， 其余位点的赖氨酸突变为精氨 酸。 8.如权利要求1所述方法处 理后的骨髓前体细胞在制备肿瘤免疫药物中的应用。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115466721 A 233位点单泛素分子增强骨髓前 体细胞免疫功能的方 法 技术领域 [0001]本发明涉及基因工程技术领域， 尤其是涉及一种33位点单泛素分子增强骨髓前体 细胞免疫功能的方法。 背景技术 [0002]骨髓(Bone  Marrow,BM)是存在于长骨(如肱骨、 股骨)的骨髓腔和扁平骨(如骼骨) 的稀松骨质间的网眼中， 是一种海绵状的组织,包含了不同种类的干细胞， 其中包括造血干 细胞， 以及一些不太丰富的非造血间充质干细胞。 造血干细胞在造血微环境中可分化为三 系(白细胞、 红细胞、 血小板)祖细胞， 三系祖细胞在各造血因子的作用下， 分化为各血细胞 前体细胞， 前体细胞在良好的环境和充足的营养组分条件下， 进一步分化为 成熟的血细胞， 进入血液循环中。 文中涉及的骨髓前体细胞(Bone  Marrow Precursor  Cells)是造血干细 胞在IL‑4(白介素4)及GM ‑CSF(粒细胞巨噬细胞集落刺激因子)的刺激诱导下形成的一种已 经部分分化的树突状细胞前体细胞， 其分化潜能为单能性， 较祖细胞更少， 可视为从干细胞 分化到树突状细胞的最后一步， 是树突状细胞较为幼稚的状态。 (Dzierzak,E.&Speck, N.A.Of lineage and legacy:the  development  of mammalian  hematopoietic  stem  cells.Nature  Immunol.9,129–136(2008).) [0003]泛素分子(ubiquitin,Ub)由76个氨基酸组成， 在真核细胞中广泛表达。 其含有7个 赖氨酸残基(K6、 K 11、 K27、 K29、 K33、 K48和K63)， 通 常一个泛素分子的C末端甘氨酸可与另一 个泛素分子中任意一个赖氨酸的ε ‑氨基结合形成多聚泛素化(poly ‑ubiquitination)； 因 此， 可以产生7种不同结构的泛 素链， 多样的泛素链连接方式可引导底物蛋白走向不同的命 运， 发生不同的细胞反应(Malynn  BA,Ma A.Ubiquitin  makes its mark on immune  regulati on Immunity,2010,3 3:843‑52.)。 [0004]此外， 泛素分子还可以通过单个分子或线性化的方式连接到底物靶蛋白上形成单 泛素化(mono  ubiquitiantion)或线 性泛素化(linear  ubiquitination)， 以发挥不同的调 控功能。 [0005]在有关泛素化的科学研究中， K48和K63的泛素化由于含量较高且研究得比较清楚 且称为经典性的泛 素化， 其他泛 素化方式为非经典性泛素化。 近年来， 通过K6、 K11、 K27、 K29 和K33残基组装的其他类型的泛素化链也渐获得关注。 如K6连接的泛素化被证明与线粒体 自噬及DNA损伤应答有关； K27和k29连接链的存在促进了蛋白酶体和自噬降解， 以及与帕金 森病(PD)相关的蛋白聚集等等(Nucifora  FC Jr,Nucifora  LG,Ng CH,Arbez  N,Guo Y, Roby E,et al.Ubiqutination  via K27 and K29 chains signals aggregation  and  neuronal  protection  of LRRK2 by WSB1.Nat  Commun.2016； 7:11792.)， 而关于K33的文 献报道仍较少。 [0006]泛素化过程在BMPCs成熟、 迁移、 适应性免疫、 维持内环境稳定有重要意义。 You  X 等以泛素化抑制剂PYR ‑41或沙度利胺(Thalidomide)抑制NF ‑KB通路泛素化， 观察到内体对 p97及Sec61的招募减少并致内化抗原的细胞质移位降低， 损害BMPCs的抗原提呈能力。 当说　明　书 1/5 页 3 CN 115466721 A 3