(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202211043903.9 (22)申请日 2022.08.29 (71)申请人 厦门大学 地址 361005 福建省厦门市思明区思明南 路422号 (72)发明人 周子健　石昌荣　陈小元　张倩玉　 (74)专利代理 机构 厦门南强之 路专利事务所 (普通合伙) 35200 专利代理师 张素斌 (51)Int.Cl. A61K 47/69(2017.01) A61K 47/60(2017.01) A61K 47/68(2017.01) A61K 31/4015(2006.01) A61K 31/445(2006.01)A61K 49/16(2006.01) A61K 49/18(2006.01) A61P 29/00(2006.01) A61P 35/00(2006.01) A61P 39/06(2006.01) (54)发明名称 T细胞免疫活性的可视化调控探针构建及其 应用 (57)摘要 T细胞免疫活性的可视化调控探针构建及其 应用， 包括活性氧清除基团R1、 T细胞靶向抗体片 段R2及融合脂质体单元， 其中融合脂质体单元由 DOPE、 DOPE ‑PEG2000‑MAL及正电荷脂质DOTAP组 成； 可视化调控探针利用两亲性 分子通过自组装 形成球形脂质体囊泡结构， 且R1、 R2分别与DOPE ‑ PEG2000‑MAL的亲水端共价耦连。 通过水化薄膜法 制备， 分散性良好， 靶向修饰范围广， 对T细胞免 疫活性的调控性能优越。 活性氧清除基团展示到 T细胞膜表面， 充当活性氧诱饵， 使T细胞抵抗失 活， 同时为T细胞免疫活性激活的MRI定量提供质 子T1弛豫时间的显著变化， 用于T细胞免疫活性 相关疾病的可视化调控及早期疗效评价。 权利要求书1页 说明书5页 附图3页 CN 115364243 A 2022.11.22 CN 115364243 A 1.T细胞免疫活性的可视化调控探针， 其特征在于： 包括活性氧清除基团R1、 T细胞靶向 抗体片段R2及融合脂质体单元， 其中融合脂质体单元由DOPE、 DOPE ‑PEG2000‑MAL及正电荷脂 质DOTAP组成； 所述的可视化调控探针利用两亲性分子通过自组装形成球形脂质体囊泡结 构， 且R1、 R2分别与DOPE ‑PEG2000‑MAL的亲水端共价耦连。 2.如权利要求1所述的T细胞免疫活性的可视化调控探针， 其特征在于： 所述活性氧清 除基团R1采用硝基氧类活性氧捕获剂。 3.如权利要求2所述的T细胞免疫活性的可视化调控探针， 其特征在于： 所述活性氧清 除基团R1包括2,2,6,6 ‑四甲基哌啶(TEMP)、 5,5 ‑二甲基‑1‑吡咯啉‑N‑氧化物(DMPO)和 BocMPO中的至少一种。 4.如权利要求1所述的T细胞免疫活性的可视化调控探针， 其特征在于： 所述T细胞靶向 抗体片段R2包括anti ‑CD3、 anti ‑CD4、 anti ‑CD8、 anti‑CD25及anti ‑TIM‑3中的至少一种。 5.权利要求1～4任一项所述的T细胞免疫活性的可视化调控探针的制备方法， 其特征 在于包括如下步骤： 1)合成活性氧清除单 元结构DOPE‑PEG2000‑R1； 2)将DOPE、 DOPE ‑PEG2000‑MAL、 DOPE ‑PEG2000‑R1、 正电荷脂质DOTAP在溶剂中混匀后， 蒸干 溶剂， 加入磷酸盐缓冲液PBS分散， 然后涡旋以产生多层脂质体囊泡， 随后超声波均质得到 单层融合脂质体囊泡； 3)通过连接T细胞靶向抗体片段R2制备T细胞免疫活性的可视化调控探针。 6.如权利要 求5所述的制备方法， 其特征在于步骤1)的制备如下： 将DOPE ‑PEG2000‑MAL和 巯基化R1混合在磷酸盐缓冲液PBS中， 氮气保护条件下反应， 透析袋除去未反应的原料化合 物， 将透析后的溶 液冻干， 得到固体产物即为DOPE ‑PEG2000‑R1。 7.如权利要求5所述的制备方法， 其特征在于： 步骤2)中涉及组分DOPE、 DOPE ‑PEG2000‑ MAL、 DOPE ‑PEG2000‑R1、 DOTAP的摩尔比为DOPE： DOPE ‑PEG2000‑MAL： DOPE ‑PEG2000‑R1： DOTAP＝1： (0.1～0.5)： (0.1～0.5)： 1。 8.如权利要求5所述的制备方法， 其特征在于步骤3)的制备如下： 用二硫苏糖醇(DTT) 还原T细胞靶向抗体片段R2， 然后用脱盐柱除去游离DTT， 最后与步骤2)中得到的单层融合 脂质体囊泡进行化学 连接。 9.如权利要求8所述的制备方法， 其特征在于： 所述化学连接是在氮气保护下反应， 然 后在磷酸盐缓冲液PBS溶 液中旋洗纯化， 即得T细胞免疫活性的可视化调控探针。 10.T细胞免疫活性的可视化调控探针的应用， 其特征在于： 用于T细胞免疫活性相关疾 病的可视化调控及治疗 疗效的早期评价。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115364243 A 2T细胞免疫活性的可视化调控探针构建及其应用 技术领域 [0001]本发明涉及医药技术领域， 尤其涉及T细胞免疫活性的可视化调控探针构建及其 应用。 背景技术 [0002]健康机体中的T细胞拥有稳定 的代谢功能及分化能力， 进而维护着机体的正常免 疫防御功能。 当体内T细胞的代谢功能和数量 发生异常改变时， 机体就可能出现一系列的免 疫代谢紊乱， 进而引发机体的病理变化。 临床 研究表明， 肿瘤、 急/慢 性感染、 代谢综合征、 免 疫缺陷性病等疾病的发生发展都与T细胞免疫活性的异常改变相关。 因此， 基于T细胞免疫 活性的研究对了解疾病的发病机制、 控制疾病的发生 发展进程以及指导临床治疗都有极其 重要的意义。 然而， 细胞存在多因素引起的耗竭现象， 进而导致病理微环境中T细胞的数量 无法准确反映其免疫活性。 因此， 针对T细胞免疫活性的可视化调控对于T细胞免疫活性异 常相关疾病的精准疗效调控和预后评价有重要意 义。 [0003]临床上病理组织活检是监测细胞活性的金标准， 但其受取材位置等因素的限制， 往往容易引起假阳性或者假阴性的结果， 给临床 医生的正确判断造成了极大 的干扰。 与传 统的侵入性组织活检方法相比， 分子影像技术可以提供更快捷、 更精确、 更高时间分辨率、 更高空间分辨率的解剖结构与功 能成像信息， 为药物研发、 治疗方案优化等提供了更加有 效的工具。 目前针对T细胞的活体成像主要基于细胞特异 性标志物的生物结合靶向策略， 其 结果主要反映T细胞的数量和受体分布， 无法准确揭示T细胞的免疫活性。 [0004]多项研究表明： 不同类型T细胞的增殖、 活化及自身稳态的维持与其所处的微环境 息息相关。 环境中的活性氧水平对T细胞的功能和活性也起着关键性作用。 活性氧生成和清 除的不平衡会引起T细胞严重损伤和潜在的细胞死亡。 例如： 肿瘤微环境中， 大量炎症活性 氧反应会引起肿瘤中氧化应激水平的升高， 使得T细胞降低 或失去， 进而表现免疫耐受； 自 身免疫性疾病(如类风湿性关节炎)中， 高剂量的炎症活性氧会使得调节性T细胞(Treg)活 性降低或损失， 免疫失衡进而加剧疾病进程。 进一步研究表明， T细胞的免疫活性与其膜表 面还原性蛋白(例如Trx)的自由巯基( ‑SH， 还原态)数量成正比， 而与双硫键(S ‑S， 氧化态) 数量成反比。 在活性氧微环 境中， T细胞膜表 面的还原性蛋白容易被氧化( ‑SH变为S‑S)而失 去其增殖能力 及免疫活性。 基于活性氧环境中T细胞膜表面的氧化还原状态( ‑SH和S‑S的平 衡)与T细胞免疫活性之间的相互关系， 靶向T细胞膜表 面‑SH和S‑S的平衡状态有望实现对T 细胞免疫活性的诊疗调控， 并为肿瘤放疗的疗效调控和预后评价提供新思路。 然而， 基于T 细胞膜表面氧化还原状态的靶向调控存在挑战， 针对T细胞免疫活性的可视化调控及其诊 疗应用研究目前鲜有报道。 [0005]硝基氧类 活性氧捕获剂是一类广泛用于检测和量化活性氧物种的试剂， 包括2， 2， 6， 6‑四甲基哌啶(TEMP)、 5， 5 ‑二甲基‑1‑吡咯啉‑N‑氧化物(DMPO)、 BocMPO等。 其不仅可实现 抗氧化作用， 在活性氧捕获过程中逆磁性捕获剂分子自身还可以被氧化形成顺磁性的稳定 自由基， 进而在磁共振成像中实现信号的放大。 不同于放射性核素的分子标记成像方法说　明　书 1/5 页 3 CN 115364243 A 3