(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202211257362.X (22)申请日 2022.10.14 (71)申请人 浙江大学 地址 310000 浙江省杭州市西湖区余杭塘 路866号 (72)发明人 吴希美　王继荣　姚敏俐　唐超　 何强强　许成云　曾玲晖　 (74)专利代理 机构 北京精翰专利代理有限公司 11921 专利代理师 李彬 (51)Int.Cl. C07K 16/06(2006.01) C07K 16/18(2006.01) C07K 7/08(2006.01) C07K 1/04(2006.01)C07K 1/16(2006.01) G01N 33/574(2006.01) G01N 33/68(2006.01) A61K 39/395(2006.01) A61P 35/00(2006.01) A61P 25/00(2006.01) A61P 11/00(2006.01) (54)发明名称 一种人GLI1蛋白Ser937位点磷酸化抗体的 制备方法及其应用 (57)摘要 本发明公开了一种人GLI1蛋白Ser937位点 磷酸化抗体的制备方法， 包括如下步骤： (1)确定 人GLI1Ser937蛋白磷酸化位点； (2)根据GLI1靶 点序列及已知的磷酸化位点Ser9 37， 设计需要 合 成的磷酸化及非磷酸化多肽序列； (3)合成氨基 酸序列的抗原合成肽， 将该多肽与载体蛋白偶联 用作抗原； (4)将步骤(3)合成的抗原合成肽免疫 动物并收集抗血清； (5)将步骤(4)收集的抗血清 进行纯化和鉴定， 得到 人GLI1蛋白Ser9 37位点磷 酸化抗体。 本发明制备得到的高特异性的人GLI1 蛋白Ser937位点磷酸化抗体可用Western  blot 实验检测正常细胞、 肿瘤细胞的表达差异， 有助 于研究GLI1蛋白的磷酸化修饰在肿瘤疾病发生 发展过程中的作用， 为临床肿瘤疾病的诊断或治 疗提供潜在的作用靶点。 权利要求书1页 说明书6页 附图6页 CN 115505039 A 2022.12.23 CN 115505039 A 1.一种人GL I1蛋白Ser 937位点磷酸化抗体的制备 方法， 其特 征在于， 包括如下步骤： (1)确定人GL I1 Ser937蛋白磷酸 化位点； (2)根据GLI1靶点序列及已知的磷酸化位点Ser937， 设计需要合成的磷酸化及非磷酸 化多肽序列； (3)合成氨基酸序列的抗原合成肽， 将该多肽与载体蛋白偶联用作抗原； (4)将步骤(3)合成的抗原合成肽免疫动物并收集 抗血清； (5)将步骤(4)收集的抗血清进行纯化和鉴定， 得到人GLI1蛋白Ser937位点磷酸化抗 体。 2.如权利要求1所述的一种人GLI1蛋白Ser937位点磷酸化抗体的制备方法， 其特征在 于， 所述步骤(3)中的磷酸 化多肽序列为： PAQEPSYQp[S937]PKFLG‑Cys。 3.如权利要求1所述的一种人GLI1蛋白Ser937位点磷酸化抗体的制备方法， 其特征在 于， 所述步骤(3)中的合成多肽的方式为固相合成法， 并通过HPLC条件进行纯化， 且纯度> 95％。 4.如权利要求1所述的一种人GLI1蛋白Ser937位点磷酸化抗体的制备方法， 其特征在 于， 所述步骤(3)中的载体蛋白为钥孔血蓝蛋白。 5.如权利要求1所述的一种人GLI1蛋白Ser937位点磷酸化抗体的制备方法， 其特征在 于， 所述步骤(5)中的鉴定方式为： 通过EL ISA检测。 6.一种人GLI1蛋白Ser937位点磷酸化抗体的应用， 其特征在于， 应用于肿瘤、 神经系 统、 呼吸系统疾病的诊断、 治疗及预后判定的药物制剂中。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115505039 A 2一种人GLI1蛋白Ser937位点 磷酸化抗体的制备方 法及其应用 技术领域 [0001]本发明涉及抗体技术领域， 具体为一种人GLI1蛋白Ser937位点磷酸化抗体的制备 方法及其应用。 背景技术 [0002]Hedgehog(HH)信号通路在哺乳动物器官发育、 再生和体内平衡中具有重要意义， HH通路的失调被发现是先天性综合征的原因。 在脊椎动物中， HH配体包括Sonic  HH(SHH)、 Indian HH(IHH)和Desert  HH(DHH)， 分别在不同的组织器官中差异表达。 IHH参与软骨内骨 化， DHH的作用 局限于卵巢颗粒细胞和 睾丸支持细胞等性腺， SHH在胚胎发育的各个阶段具 有时空表达特性， 保持着活跃的状态， 但是在成年后的机体中， SHH通路的活性显著下降。 SHH通路的异常表达会导致机体大脑， 肺， 肾上腺， 肢体等器官和组织的发育异常及相关疾 病发生。 此外， S HH信号随后被证明可以在成年组织中调节干细胞的稳态， 持续的SHH信号激 活引发多种肿瘤发生， 如皮肤基底细胞癌、 肺癌、 胰腺癌、 前列腺癌、 胃癌、 结肠癌、 食道癌、 乳腺癌与肝癌等。 研究HH信号的调控将不仅为组织器官的生理过程而且为其病理过程提供 新的理论， 具有重要的意 义。 [0003]Hedgehog信号通路主要由分泌型糖蛋白配体Hedgehog、 跨膜型蛋白受体Patched (PTCH)和跨膜G蛋白偶联型受体Smoothene d(SMO)及转录因子GLI家族组成。 PTCH是一种12 次跨膜型蛋白， 具有结合HH配体及抑制SM O受体的双重功能。 在配体缺失情况下， PTCH与SM O 结合并抑制其活性， 关键转录因子 GLI在蛋白酶体内被截断， 并以羧基端被截断的形式进入 细胞核内， 抑制下游靶基因的转录。 但当HH配体存在时， PTCH与HH配体结合， 解除对S MO的抑 制， SMO向初级纤毛顶端移位， 进一步激活GLI转录因子家族， 激活下游靶基因Cyclin  D1、 Myc、 PTCH和GLI1等的转录， 参与细胞的增殖及组织的分化。 [0004]脊椎动物中GLI转录因子包括GLI1、 GLI2和GLI3， 是HH信号激活或者失活下游靶基 因的关键转录因子。 当没有SHH刺激时， GLI2和GLI3通过PKA、 GSK3β和CK1激酶磷酸化以及 SCF/β‑TRCP泛素连接酶的有限降解， 使得GLI2和GLI3被翻译后修饰成转录抑制形式而抑制 SHH信号。 当存在SHH刺激时， SMO通过Cos2/Kif7和SuFu两个抑制性调节分子结合， 抑制PKA 活性而增加GLI2和GLI3的转录激活形式激活SHH信号靶基因转录。 GLI1既是HH通路的激活 因子也是其靶基因， 因此GLI1的表达水平可反映HH通路的活化程度。 在GLI1翻译后修饰方 面， AMPK激酶不仅减少GLI1的核定位且磷酸化S 102‑、 S408‑和T1074‑GLI1导致其β ‑TrCP中 介的泛素化降解而抑制HH信号。 MEKK2和MEKK3通过磷酸化GLI1的S201、 S204、 S243、 S968、 T1074和S1078位点影响GLI1蛋 白稳定性、 与SuFu的结合能力以及与DNA的结合能力而抑制 GLI1转录活性。 MEKK1磷酸化GLI1多个位点而抑制HH信号活性和髓母细胞瘤增殖。 Plk1激酶 通过磷酸化GLI1的S481位点而增加GLI1核输出以及与SuFu的结合， 而抑制HH信号。 阐明 GLI1翻译后修饰的调控机制有助于深入理解H H信号功能。 [0005]现有的GLI1磷酸化抗体虽然可以用于Westernblot实验检测正常细胞、 肿瘤细胞 的表达差异， 但尚未有做免疫组化的， 也无法为临床肿瘤疾病的诊断或治疗提供潜在的作说　明　书 1/6 页 3 CN 115505039 A 3