(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202211152780.2 (22)申请日 2022.09.21 (71)申请人 天津大学 地址 300000 天津市南 开区卫津路9 2号 (72)发明人 乔欢欢　吴婕婷　张晓东　 (74)专利代理 机构 北京知艺互联知识产权代理 有限公司 16137 专利代理师 陈艳 (51)Int.Cl. A61K 48/00(2006.01) A61K 38/46(2006.01) A61K 41/00(2020.01) A61P 35/00(2006.01) (54)发明名称 一种介导CRISPR系统的pH响应性金团簇纳 米系统及其构建方法和应用 (57)摘要 本发明提供了一种介导CRISPR系统的pH响 应性金团簇纳米系统及其构建方法和应用， 属于 生物医药技术领域。 包括： 根据肿瘤的靶标基因 设计合成sgRNA； sgRNA与Cas9蛋白混合、 孵育 30min， 得到CRISPR ‑Cas9RNP复合物； CRISPR ‑ Cas9RNP复合物与Au25(SG)18混合、 孵育 10min， 得 到介导CRISPR系统的pH响应性金团簇纳米系统。 Cas9/sgRNA可以靶向剪切肿瘤突变基因， 改变肿 瘤的异常生物性状， 阻止肿瘤的增殖， 以达到清 除或控制肿瘤扩散的目的。 权利要求书1页 说明书7页 附图3页 CN 115414499 A 2022.12.02 CN 115414499 A 1.一种介导CRISPR系 统的pH响应性金团簇纳米系 统的构建方法， 其特征在于， 包括以 下步骤： 1)根据肿瘤的靶标基因设计合成sgRNA； 2)将所述步骤 1)得到的sgRNA与Cas9蛋白混合、 孵育30min， 得到CRISPR ‑Cas9 RNP复合 物； 3)将所述步骤2)得到的CRISPR ‑Cas9 RNP复合物与Au25(SG)18混合、 孵育10min， 得到介 导CRISPR系统的pH响应性金团簇纳米系统。 2.根据权利要求1所述的构建方法， 其特征在于， 所述步骤2)sgRNA与Cas9蛋白的摩尔 比为(0.1～ 2):1。 3.根据权利要求1或2所述的构建方法， 其特征在于， 所述sgRNA以无RNA酶水溶液的形 式与Cas9蛋白混合， 所述无RNA酶水 溶液中sgRNA的质量浓度为3 00 μg/mL。 4.根据权利要求1或2所述的构 建方法， 其特征在于， 所述Cas9蛋白以溶液形式与sgRNA 混合， 所述Cas9蛋白的溶剂为PBS缓冲液， 所述溶 液中Cas9蛋白的质量浓度为5 00 μg/mL。 5.根据权利要求1所述的构建方法， 其特 征在于， 所述 步骤1)肿瘤包括脑胶质瘤； 所述脑胶质瘤的靶标基因为脑胶质瘤突变基因PLK1， 设计合成的sgRNA的核苷酸序列 如SEQ ID No.1所示。 6.根据权利要求1所述的构建方法， 其特征在于， 所述步骤3)CRISPR ‑Cas9 RNP复合物 与Au25(SG)18的质量比为1:(2 ～40)。 7.根据权利要求6所述的构建方法， 其特征在于， 所述Au25(SG)18以溶液形式与CRISPR ‑ Cas9 RNP复合物混合， 所述Au25(SG)18的溶剂为PBS缓冲液， 所述溶液中Au25(SG)18的质量浓 度为1mg/mL。 8.一种权利要求1～7任一项所述的构建方法得到的介导CRISPR系 统的pH响应性金团 簇纳米系统。 9.权利要求8所述的介导CRISPR系统的pH响应性金团簇纳米系统在制备治疗肿瘤的药 物中的应用。 10.根据权利要求9所述的应用， 其特 征在于， 所述肿瘤包括脑胶质瘤。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115414499 A 2一种介导CRI SPR系统的p H响应性金 团簇纳米系统及其构建 方 法和应用 技术领域 [0001]本发明属于生物医药技术领域， 尤其涉及一种 介导CRISPR系统的p H响应性金团簇 纳米系统及其构建方法和应用。 背景技术 [0002]脑肿瘤的发病率随着时间的推移而增加， 胶质瘤是最常见的原发性恶性肿瘤之 一。 胶质瘤起源于颅内中性神经胶质细胞， 是一种侵袭性和致命的恶性肿瘤。 胶质瘤患者的 中位生存期约为 12‑14个月， 5年总生存率接近于零。 手术治疗中， 高度浸润性和侵袭性的神 经胶质瘤细胞模糊了肿瘤和正常脑组织之间的边界， 使其难以完全切除。 放疗或化疗， 如替 莫唑胺(TMZ)、 顺铂和放射线等， 常用于辅助治疗。 然而， 这些都可能导致强烈的副作用。 包 括全身性的反应， 如恶心、 呕吐等消 化系统反应； 白细胞和血小板减少等骨髓抑制的反应； 骨骼疼痛、 脱发、 器官功能损伤、 照射野皮肤损伤， 放射性肺炎等其他反应。 因此， 探索安全 有效的治疗策略对于胶质瘤至关重要。 肿瘤通常是 由于基因突变所导致， 因此基因突变在 肿瘤的发生和发展中发挥着至关重要的作用， 这些突变的基因可以作为有效的治疗靶标。 基因治疗被广泛定义为使用载体将核酸引入细胞， 达到改变基因表达以预防、 停止或逆转 病理过程的目的。 基因编辑， 就是对目标基因及其转录产 物进行编辑(定向改造)， 实现特定 DNA片段的加入、 删除， 特定DNA碱基的缺 失、 替换等， 以改变目的基因或调控 元件的序列、 表 达量或功能。 基因编辑工具已可用于纠正潜在的基因突变。 近期， CRISPR ‑Cas9(规律 成簇的 间隔短回文重复序列)在基因治疗中的潜在作用， 使其成为肿瘤治疗领域的热点之一。 [0003]CRISPR基因编辑可以直接修饰 目标基因， 从而改变生物体的生物学特性。 现在用 于基因组编辑的CRISPR ‑Cas9系统有两个组成部分： Cas9蛋白和小向导RNA(sgRNA)。 Cas9蛋 白可以与双链DNA相互作用并分离2条DNA链。 因此， 可以形成Cas9蛋 白、 sgRNA和DNA的三重 复合物， sgRNA的前20个核苷酸负责将复合物定位到基因组中的特定位点。 一旦复合物形 成， Cas9就会产生DNA断裂。 迄今为止， CRISPR ‑Cas9已应用于肺癌、 肝癌、 卵巢癌、 结直肠癌 等的治疗。 由于应用的广泛性， 将 CRISPR‑Cas9系统递送至靶器官或细胞需要安全有效的递 送系统。 目前 的递送载体主要包括病毒和非病毒两大类。 尽管病毒载体通过细胞转导能够 有效地递送CRISPR ‑Cas9系统， 但 仍可能在宿 主体内引起不必 要的免疫原 性和突变风险， 从 而限制其临床转化。 近年来非病毒载体尤其是纳米载体对CRISPR ‑Cas9系统递送的研 究取 得了一定进展。 现有技术中， 缺乏有关于使用非病毒载体同时将 Cas9蛋白和sgRNA递送的报 道。 发明内容 [0004]有鉴于此， 本发明的目的之一在于提供一种通过Au25(SG)18包裹Cas9蛋白、 sgRNA 的策略， 合 成CRISPR ‑Cas9的非病毒 载体的构建方法， 本发明的目的之二在于提供一种同时 递送CRISPR系统Cas9蛋白和sgRNA的pH响应性金团簇纳米系统； 本发明的目的之三在于提说　明　书 1/7 页 3 CN 115414499 A 3