(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210916096.0 (22)申请日 2022.08.01 (71)申请人 江苏师范大学 地址 221116 江苏省徐州市铜山 新区上海 路101号 (72)发明人 樊少华　王艳艳　黄文逸　李军　 宗锐　 (74)专利代理 机构 南京纵横知识产权代理有限 公司 32224 专利代理师 雷向永 (51)Int.Cl. G01N 33/574(2006.01) C12N 15/867(2006.01) A61K 45/00(2006.01) A61P 35/00(2006.01)A61P 35/04(2006.01) (54)发明名称 一种基于LASS2基因介导肾癌进展的新机制 及预警应用方法 (57)摘要 本发明公开了一种基于LASS2 基因介导肾癌 进展的新机制及预警应用方法， 用于非疾病诊断 和治疗， 包 括LASS2介导肾癌细胞增殖、 迁移和侵 袭的新机制及预警应用。 检索人类蛋白质图谱 (Human Protein Atlas， HPA)数据库， 确定LASS2 水平与肾癌患者的生存期是否具有显著相关性。 Western blot方法检测了LASS2在肾癌细胞系 786‑O、 A‑498、 Caki ‑1、 Caki‑2、 ACHN、 RCC4和 SLR21， 以及人肾近曲小管上皮细胞HK ‑2中的蛋 白水平。 构建LASS2干扰/过表达质粒， 进行慢病 毒包装， 建立稳转细胞株。 利用CCK ‑8增殖实验、 克隆形成实验、 伤口愈合实验、 Transwell实验， 检测敲减/过表达LASS2基因后， 肾癌细胞的增 殖、 迁移和侵袭情况。 利用蛋白质鉴定技术， 通过 Western Blot检测Hippo通路中关键蛋白(MOB1, YAP,TAZ,c ‑Myc和SOX2)的水平。 权利要求书1页 说明书9页 附图10页 CN 115236333 A 2022.10.25 CN 115236333 A 1.一种基于LASS2基因介导肾癌进展的新机制及预警应用方法， 用于非疾病诊断和治 疗， 其特征在于： 包括LASS2介导肾癌细胞增殖、 迁移和侵袭的新机制及预警应用， 所述 LASS2介导肾癌细胞增殖、 迁移和侵 袭的新机制及预警应用包括以下步骤： 步骤A： 检索人类蛋白质图谱(Human  Protein Atlas， HPA)数据库， 确定LASS2水平与肾 癌患者的生存期具有显著相关性； 步骤B： 根据蛋白质免疫印迹法Western  blot检测LASS2在肾癌细胞系786 ‑O、 A‑498、 Caki‑1、 Caki‑2、 ACHN、 RCC4和SLR21， 以及人肾近曲小管 上皮细胞HK ‑2中的蛋白水平； 步骤C： 构建LAS S2敲减/过表达质粒， 进行慢病毒包 装， 建立稳转细胞株； 步骤D： 利用CCK ‑8增殖实验、 克隆形成实验、 伤口愈合实验、 Transwell实验， 检测敲减/ 过表达LAS S2基因后， 肾癌细胞的增殖、 迁移和侵 袭情况； 步骤E： 利用蛋白质鉴定技术， 检测过表达/敲减LASS2引起细胞蛋白质和通路的变化情 况， 推测LAS S2可能调控Hip po信号通路； 步骤F： 通过Western  Blot检测Hippo通路中关键蛋白的水平， 关键蛋白至少包括MOB1, YAP,TAZ,c ‑Myc,SOX2， 确定LASS2通过调控Hippo ‑YAP/TAZ信号通路， 介导肾癌细胞的增殖， 迁移和侵 袭。 2.如权利要求1所述的一种基于LASS2基因介导肾癌进展的新机制及预警应用方法， 其 特征在于： 所述步骤C中LASS2慢病毒质粒的构建序列， 挑选LASS2蛋白水平相对较高的A ‑ 498、 RCC4和Caki ‑1细胞进行干扰慢病毒感染， 构建LASS2对照和敲减的稳转细胞株， 分别以 Lenti‑shRNA‑vector、 Lenti ‑shRNA1‑LASS2和Lenti ‑shRNA2‑LASS2命名， 并用Western   blot方法检测LASS2的敲减效果； 挑选LASS2表达相对较低的Caki ‑2和SLR21细胞， 构建空载 对照和过表达LAS S2的稳转细胞株， 分别以Lenti ‑vector和Lenti ‑LASS2命名。 3.如权利要求2所述的一种基于LASS2基因介导肾癌进展的新机制及预警应用方法， 其 特征在于： 所述稳转细胞株中LAS S2的蛋白水平通过Western  blot技术检测。 4.如权利要求1所述的一种基于LASS2基因介导肾癌进展的新机制及预警应用方法， 其 特征在于： 所述LASS2 基因影响肾癌细胞增殖、 迁移和侵袭的能力通过Cell  Counting  Kit‑ 8实验、 克隆形成实验、 伤口愈合实验和Transwel l实验初步 鉴定。 5.如权利要求1所述的一种基于LASS2基因介导肾癌进展的新机制及预警应用方法， 其 特征在于： 所述LASS2的互作蛋白及调控的通路通过免疫共沉淀技术、 LC ‑MS/MS蛋白质鉴定 技术结合生物信息学技 术寻找。 6.如权利要求1所述的一种基于LASS2基因介导肾癌进展的新机制及预警应用方法， 其 特征在于： 所述 LASS2基因应用在制备治疗或诊断肾癌药物领域中的应用。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115236333 A 2一种基于LAS S2基因介导肾癌进展的新 机制及预警应用方 法 技术领域 [0001]本发明属于基因工程技术领域， 具体涉及LASS2基因介导肾癌进展的新机制及预 警应用方法。 背景技术 [0002]肾癌是世界范围内第六最常见的癌症， 在男性中的发病机率要比女性高， 占所有 癌症的5％[Capitanio  U,Bensalah  K,Bex A,et al.Epidemiology  of renal cell  carcinoma.Eur  Urol,2019,75(1):74 ‑84.Siegel  R L,Miller  K D,Fuchs H E,et  al.Cancer  statistics,2022.CA  Cancer J Clin,2022,72(1):7 ‑33.]， 统计显示， 肾癌的 发病率正在逐年上升[Turajlic  S,Swanton  C,Boshoff  C.Kidney  cancer:The  next  decade.J Exp Med,2018,215(10):2477 ‑2479.]。 世界卫生组织指出， 肾癌引起的死亡超过 14万例/年， 是第13位全球最常见的癌症死亡原因。 肾癌在早期难以被发现， 很多患者在晚 期才被确诊。 大部分肾癌患者的致死原因是肿瘤转移和术后复发， 大约30％的早期患者在 切除肾肿瘤后发生复发[Li  F,Hu W,Zhang W,et al.A 17‑gene signature  predicted   prognosis  in renal cell carcinoma.Dis  Markers,2020,2020:8352809.]， 约有20％的 患者复诊时出现了肿瘤转移[Dabestani  S,Thorstenson  A,Lindblad  P,et al.Renal   cell carcinoma recurrences  and metastases  in primary non‑metastatic  patients: a population‑based study.World  J Urol,2016,34(8):1081 ‑1086.]。 局部性肾细胞癌可 以通过肾肿瘤切除手术进行治疗， 而晚期或转移性的肾细胞癌需要化疗、 放射性治疗和免 疫治疗这些手段， 但治疗效果有限， 因为转移 性肾细胞癌通常对化疗、 靶向治疗和放疗具有 耐受性， 需要持续治疗， 缺乏持久的临床反应[Rosenberg  S A,Lotze M T,Muul L M,et  al.A progress  report on the treatment  of 157patients  with advanced  cancer  using lymphokine ‑activated  killer cells and interleukin ‑2or high dose  interleukin ‑2alone.N  Engl J Med,1987,316(15):889 ‑897.]。 因此， 研究肾癌细 胞的增 殖、 迁移和侵 袭的分子 机制将为治疗肾癌提供新的思路。 [0003]人源性长寿保障基因2(Homo  sapiens longevity  assurance  homolog 2of  yeast LAG1， LASS2)或可称为神经酰胺合酶2(ceramide  synthase  2， CerS2)， 是从人肝脏 cDNA文库克隆出来的一个基因。 LASS2在肝肾中有较高的转录水平， 在鞘脂代谢中也 发挥着 重要的作用[Levy  M,Futerman  A H.Mammalian  ceramide  synthases.IUBMB  Life,2010, 62(5):347 ‑356.]， 同时LASS2在哺乳动物器官和组织中普遍存在， 是迄今为止表达最丰富 的LASS家族成员， 也是研究程度最深的一个成员。 研究