(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210996028.X (22)申请日 2022.08.19 (71)申请人 中国科学院高能物理研究所 地址 100049 北京市石景山区玉泉路19号 (乙)院 (72)发明人 陈奎　吕林雯　邢更妹　 (74)专利代理 机构 青岛智地领创专利代理有限 公司 37252 专利代理师 王晓凤 (51)Int.Cl. A61K 39/00(2006.01) A61K 38/21(2006.01) A61K 9/50(2006.01) A61K 47/46(2006.01) A61P 35/00(2006.01)A61P 35/04(2006.01) A61P 35/02(2006.01) (54)发明名称 一种基于细胞外囊泡负载的树突状细胞的 肿瘤疫苗及制备方法和应用 (57)摘要 本发明属于生物医学和肿瘤免疫技术领域， 具体涉及一种基于细胞外囊泡负载的树突状细 胞作为肿瘤疫苗及制备方法和应用。 该制备方法 包括： 分别由紫外线照射、 X射线照射、 中子射线 照射处理， 获得三种细胞外囊泡， 将处理获得的 三种细胞外囊泡分别与骨髓来源的树突状细胞 孵育24h后， 收集细胞外囊泡负载后的树突状细 胞， 孵育后显著促进了骨髓来源的树突状细胞的 成熟。 通过上述方法制备的肿瘤 疫苗可应用于抑 制肿瘤的生长或转移， 能够提供更多的肿瘤抗原 表位， 增加 免疫系统对肿瘤抗原的提呈能力， 同 时由于细胞外囊泡中含有的核酸成分， 促进了免 疫细胞产生 Ⅰ型干扰素， 并引起后续的免疫反应， 实现更强的肿瘤免疫 治疗效果。 权利要求书1页 说明书7页 附图5页 CN 115414474 A 2022.12.02 CN 115414474 A 1.一种基于细胞外囊泡负载的树突状细胞的肿瘤疫苗的制备方法， 其特征在于， 具体 步骤如下： 步骤一、 分别由紫外线照射、 X射线照射、 中子射线照射处理， 获得三种经过处理的细胞 外囊泡， 分别命名为UMP、 XMP、 BMP； 步骤二、 将步骤一制备的三种细胞外囊泡分别与树突状细胞孵育24h后， 收集三种细胞 外囊泡负载后的树 突状细胞。 2.根据权利要求1所述的一种基于细胞外囊泡负载的树突状细胞的肿瘤疫苗的制备方 法， 其特征在于， 所述步骤一中， 紫外线照射细胞外囊泡1h后， 加入一定培养基， 37℃、 5％ CO2条件下继续培养72h， 收集上清； 4℃、 离心10min， 去除沉淀的细胞， 收集上清； 4℃、 离心 2min， 去除沉淀的细胞碎片， 收集上清； 4℃、 离心1h， 收集 沉淀， 即为得到的UMP； 处理得到XMP和BMP的方法同上， 仅需改变照射的条件， XMP是通过160Kv、 14Gy剂量 的X 射线照射后获得， BMP则是通 过BNCT制备方法， 以2.57 ×108cm‑2·s‑1剂量的中子 射线照射1h 后获得。 3.根据权利要求2所述的一种基于细胞外囊泡负载的树突状细胞的肿瘤疫苗的制备方 法， 其特征在于， 所述BNCT方法制备的BMP包括细胞外囊泡本体、 外泌体和凋亡小体。 4.根据权利要求1所述的一种基于细胞外囊泡负载的树突状细胞的肿瘤疫苗的制备方 法， 其特征在于， 所述步骤二中， 树突状细胞是骨髓来源的树突状细胞， 三种细胞外囊泡负 载后的树 突状细胞分别命名为UMP@BMDC、 XMP@BMDC、 BMP@BMDC 。 5.根据权利要求1至4任一项所述的制备方法制备的一种基于细胞外囊泡负载的树突 状细胞的肿瘤疫苗。 6.根据权利要求5所述的一种基于细胞外囊泡负载的树突状细胞的肿瘤疫苗， 其特征 在于， 所述疫苗 实现免疫的方法是通过肌肉静脉注射， 并在第一次注 射后第7天和 第21天再 次注射， 免疫三次。 7.根据权利要求5所述的一种基于细胞外囊泡负载的树突状细胞的肿瘤疫苗， 其特征 在于， 所述疫苗使用时， UMP@BMDC、 XMP@BMDC、 BMP@BMDC的浓度均为1 ×106cells/mL。 8.根据权利要求5所述的一种基于细胞外囊泡负载的树突状细胞的肿瘤疫苗在抑制肿 瘤生长或转移的应用。 9.根据权利要求8所述的应用， 其特征在于， 所述肿瘤针对黑色素瘤， 包括乳腺癌、 直结 肠癌、 肺癌、 肝癌、 胃癌、 食管癌、 、 膀胱癌、 宫颈癌、 卵巢癌、 骨肉瘤、 血管 肉瘤、 淋巴肉瘤、 白 血病， 还包括原位肿瘤模型及肿瘤转移模型。 10.根据权利要求8所述的应用， 其特征在于， 抑制肿瘤生长或转移的过程为： 构建肿瘤 疫苗平台， 利用在体外负载MP的BMDC制成的自体DC疫苗能够在体内有效激活适应性免疫， 通过DC细胞将肿瘤抗原有效呈递到细胞膜表 面， 与T细胞结合后引起CD8+T对肿瘤细胞的特 异性杀伤， 同时分泌的 Ⅰ型干扰素能够协同诱导产生抗肿瘤免疫效应， 最 终达到对肿瘤的生 长或转移进行抑制的效果。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115414474 A 2一种基于细胞外囊泡负载的树突状细胞的肿瘤疫苗及制备方 法和应用 技术领域 [0001]本发明属于生物医学和肿瘤免疫技术领域， 具体涉及一种基于细胞外囊泡负 载的 树突状细胞作为肿瘤疫苗及制备 方法和应用。 背景技术 [0002]肿瘤的免疫治疗是旨在于通过提高机体的免疫反应， 控制肿瘤 生长及转移的一种 疗法， 在近年来备受关注， 并于2013年被Science评为年度十大科技突破之首。 肿瘤免疫治 疗策略可分为非特异性治疗和特异性治疗， 后者又包括肿瘤疫苗、 过继性免疫细胞疗法及 单抗治疗。 其中肿瘤疫苗是一种 经济而高效的治疗手段， 利用给免疫系统直接提供肿瘤抗 原或提供免疫细胞， 激活抗肿瘤免疫反应， 重塑肿瘤免疫微环境， 最 终达到抑制肿瘤发生 发 展的目的。 [0003]肿瘤疫苗在体内发挥功能的前提即高效完成抗原提呈过程， 肿瘤抗原来源包括全 肿瘤细胞裂解物、 细胞外囊泡、 纯化的蛋白质大分子等， 其被抗原提呈细胞(antigen   presentation  cells， APC)吞噬后， 抗原释放到胞质， 发生交叉呈递， 外源性抗原被主要组 织相容复合体(MHC， major  histocompatibility  complex) Ⅰ类分子呈递到细胞膜表面， 同 时APC成熟并表达共刺激因子(如CD80， CD86)， MHC Ⅰ和CD8+T细胞表面的T细胞受体(T  cell  receptor， TCR)识别并将抗原提呈给T细胞， 共刺激因子和T细胞表 面的受体识别， 进一步强 化T细胞的活化， 产生的细胞毒性T细胞(cytotoxic  lymphocyte， CTL)特异性杀伤肿瘤细 胞， 抑制肿瘤的生长及转移。 [0004]在不断的研究发展中， 肿瘤疫苗可以大致分为以下几类： [0005](1)多肽、 蛋白质、 核酸类的分子疫苗， 主要由通过一定手段纯化得到的肿瘤特异 性抗原(tumor  specific  antigen， TSA)或肿瘤相关抗原(tumor  associated  antigen， TAA)多肽及蛋白， 或编码TSA或TAA的核酸物质作为疫苗直接对机体进行免疫， 这类分子疫 苗具有生产相 对简单且安全的优势， 但仍存在TSA或TAA发现较为困难， 肿瘤细胞普遍具有 异质性的发展瓶颈； [0006](2)病毒载体疫苗或细菌疫苗， 包含多种复杂成分， 尽管发挥功能的机制并不明 确， 但在临床测试中仍表现出了 显著的疗效； [0007](3)细胞疫苗， 利用肿瘤细胞裂解物或基因修饰过的肿瘤细胞为主体的疫苗， 包括 利用肿瘤细胞分泌的细胞外囊泡作为疫苗， 或利用肿瘤来源的抗原在体外将肿瘤抗原与自 体DC或同源DC共孵育使其激活， 再将激活后的DC细胞作为肿瘤疫苗回输到患者体内， 从而 引起后续的免疫反应， 杀伤肿瘤 细胞。 [0008]DC细胞作为最重要的抗原提呈细胞， 且体外培养方法较为成熟， 使DC疫苗在肿瘤 疫苗中获得了大量的关注及研究， 2010年Provenge疫苗成为FDA批准的第一个治疗性肿瘤 疫苗， 是由自体树突状细胞(den dritic cells， DCs)和融合蛋 白在体外孵育后回输到患者 体内的肿瘤疫苗， 用于治疗前列腺癌， 且有效延 长了患者存活时间。 同时针对其他恶 行肿瘤说　明　书 1/7 页 3 CN 115414474 A 3