(19)国家知识产权局 (12)发明 专利 (10)授权公告 号 (45)授权公告日 (21)申请 号 202211015477.8 (22)申请日 2022.08.24 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 115068630 A (43)申请公布日 2022.09.20 (73)专利权人 山东大学齐鲁医院 地址 250012 山东省济南市历下区文化西 路107号 (72)发明人 姚舒　宋坤　孔北华　褚然　刘昶　 王仔莹　 (74)专利代理 机构 北京东方盛凡知识产权代理 有限公司 1 1562 专利代理师 菅士腾 (51)Int.Cl. A61K 47/69(2017.01)A61K 47/54(2017.01) A61K 47/68(2017.01) A61K 41/00(2020.01) A61K 39/395(2006.01) A61K 38/44(2006.01) A61K 33/32(2006.01) A61K 33/26(2006.01) A61P 35/00(2006.01) 审查员 马骥 (54)发明名称 一种温敏控释四氧化三铁/PD-L1单抗修饰 纳米颗粒的制备方法 (57)摘要 本发明公开了一种温敏控释四氧化三铁/ PD‑L1单抗修饰纳米颗粒的制备方法， 属于靶向 纳米材料技术领域。 以温敏磷脂为骨架， 包裹四 氧化三铁， 化学偶联二氧化锰、 叶酸、 葡萄糖氧化 酶和PD‑L1单克隆抗体。 本发明制备得到的纳米 颗粒提高了材料的稳定性和偶联率， 降低了纳米 药物对机体的毒副作用， 减少PD ‑L1的使用量。 利 用温敏材料实现肿瘤缓释效果， 叶酸的主动靶向 特性提高纳米材料肿瘤聚集， 葡萄糖氧化酶在消 耗葡萄糖的同时产生了芬顿反应的原材料H2O2， H2O2作为四氧化三铁和二氧化锰协同诱导肿瘤 铁死亡反应原材料， 提高肿瘤杀伤效果， PD ‑L1通 过竞争抑制解除对T淋巴细胞的抑制作用， 诱导T 细胞活化， 促进肿瘤杀伤。 权利要求书1页 说明书7页 附图6页 CN 115068630 B 2022.11.04 CN 115068630 B 1.一种温敏控释Fe3O4/PD‑L1单抗修饰纳米颗粒， 其特征在 于， 以温敏磷脂为骨架， 包裹 四氧化三铁， 化学偶联二氧化锰、 叶酸、 葡萄糖氧化酶和P D‑L1单克隆抗体； 所述温敏磷脂为D PPC； 所述温敏控释F e3O4/PD‑L1单抗修饰纳米颗粒的制备 方法， 包括以下步骤： （1） Fe3O4‑OA的制备 在0.7g乙酰丙酮中， 加入25mL二苄醚、 3mL油酸和1mL油胺， 在氮气气氛下， 高温反应， 得 到所述Fe3O4‑OA； 所述高温反应具体包括： 15℃升温至2 20℃、 用时1h； 220℃维持1h； 220℃升温至2 90℃、 用时3 0min； 290℃维持5 0min； （2） Fe3O4‑DPPC/DSPE‑PEG‑COOH的制备 量取15mL浓度为1mg/mL的Fe3O4‑OA溶液， 加入80mg  DSPE‑PEG‑COOH和50mg  DPPC超声混 合均匀， 旋转蒸发， 得到F e3O4‑DPPC/DSPE‑PEG‑COOH； （3） Fe3O4‑DPPC/DSPE‑PEG‑COOH‑GOD的制备 将15mg Fe3O4‑DPPC/DSPE ‑PEG‑COOH溶解在25mL  MES缓冲液中， 加入50mg  EDC和80mg   NHS， 溶解后置于37℃摇床活化30min， 加入10mL浓度为1mg/mL的GOD， 用硼酸盐缓冲液调pH 值至8.4， 置 于37℃摇床孵 育12h， 得到F e3O4‑DPPC/COOH‑GOD； （4） MnO2‑BSA的制备 称取31.6mg  KMnO4溶解在3mL水中， 得到KMnO4溶液； 称取250mg  BSA溶解在7mL水中， 得 到BSA溶液； 搅拌状态下， 将KMnO4溶液滴加在BSA溶液中， 反应3h， 透析后冷冻干燥， 得到 MnO2‑BSA； （5） Fe3O4‑DPPC/COOH‑GOD‑MnO2的制备 将15mg Fe3O4‑DPPC/COOH ‑GOD溶解在25mL  MES缓冲液中， 加入50mg  EDC和80mg  NHS， 溶 解后置于37℃摇床活化30min， 加入10mL浓度为1m g/mL的MnO2‑BSA， 用硼酸盐缓冲液调p H值 至8.4， 置 于37℃摇床孵 育12h， 得到F e3O4‑DPPC/COOH‑GOD‑MnO2； （6） Fe3O4‑DPPC‑COOH‑GOD‑MnO2‑PDL1的制备 将15mg Fe3O4‑DPPC/COOH ‑GOD‑MnO2溶解在25mL  MES缓冲液中， 加入120mg  EDC和140mg   NHS， 37℃摇床活化30min后， 加入10 μL  PD‑L1单克隆抗体， 用硼酸盐缓冲液调pH值至8.4， 37 ℃摇床孵 育12h， 得到F e3O4‑DPPC‑COOH‑GOD‑MnO2‑PDL1； （7） Fe3O4‑DPPC‑COOH‑GOD‑MnO2‑PDL1‑FA的制备 将25mg FA溶解在25mL  MES缓冲液中， 加入50mg  EDC和80mg  NHS， 37℃摇床活化30min， 加入15mg上述Fe3O4‑DPPC‑COOH‑GOD‑MnO2‑PDL1， 用硼酸 盐缓冲液调pH值至8.4， 3 7℃摇床孵 育12h， 得到所述温敏控释F e3O4/PD‑L1单抗修饰纳米颗粒。 2.一种权利要求1所述的温敏控释Fe3O4/PD‑L1单抗修饰纳米颗粒在制备治疗卵巢癌药 物中的应用。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115068630 B 2一种温敏控释四氧化三铁/PD ‑L1单抗修饰纳米颗粒的制备 方法 技术领域 [0001]本发明涉及靶向纳 米材料技术领域， 特别是涉及一种温敏控释四氧化三铁/PD ‑L1 单抗修饰纳米颗粒的制备 方法。 背景技术 [0002]卵巢癌是卵巢肿瘤的一种恶性肿瘤， 是指生长在卵巢上的恶性肿瘤， 其中90~95% 为卵巢原发性的癌， 另外5~10%为其它部位原发的癌转移到卵巢。 由于卵巢癌早期缺少症 状， 即使有症状也不特异， 筛查的作用又有限， 因此早期诊断比较困难， 就诊 时60~70%已为 晚期， 而晚期病例又疗效不佳。 因此， 虽然卵巢癌的发病率低于宫颈癌和子宫内膜癌， 居妇 科恶性肿瘤的第三位， 但死亡率却超过宫颈癌及子 宫内膜癌之和， 高居妇科癌症首位， 是严 重威胁妇女健康的最大疾患。 [0003]并且卵巢癌预后 效果极差， 迫切需要新的治疗手段。 免疫检查点抑制剂抗肿瘤疗 效确切， 但对卵巢癌总体反应率不高； 铁死亡是最新 发现的细胞死亡方式， 易 发生于肿瘤细 胞且可激活机体免疫， 二者联合治疗肿瘤前景巨大。 纳米药物具有肿瘤靶向、 控释特性， 可 携带多种 药物实现联合、 精准治疗。 但现有技术中制备 的具有卵巢癌主动靶向和磁热响应 控释能力的纳米药物， 仅仅可以实现同时携带铁死亡诱导剂Fe3O4、 MnO2和免疫检查点抑制 剂PD‑L1单抗， 具有一定的生物学效应； 而叶酸实现卵巢癌主动靶向， DPPC实现温敏控释， Fe3O4和MnO2协同催化芬顿反应实现铁死亡和磁热效应， PD ‑L1单抗实现免疫杀伤。 但还 无法 实现纳米技术高效整合铁死亡和免疫治疗两个领域， 从而使二者协同实现纳米药物的靶向 递送和控释， 进 而显著提高杀伤效率， 为卵巢癌提供一种精准治 疗新策略。 发明内容 [0004]本发明的目的是提供一种温敏控释四氧化三铁/PD ‑L1单抗修饰纳米颗粒的制备 方法， 以解决现有技 术中存在的问题。 [0005]为实现上述目的， 本发明提供了如下 方案： [0006]本发明的技术方案之一： 一种温敏控释Fe3O4/PD‑L1单抗修饰纳米颗粒， 以温敏磷 脂为骨架， 包裹四氧化 三铁， 化学偶联二氧化锰、 叶酸、 葡萄糖氧化酶和P D‑L1单克隆抗体。 [0007]进一步地， 所述温敏磷脂为D PPC （二棕榈酰磷脂酰胆碱） 。 [0008]本发明的技术方案之二： 一种上述温敏控释Fe3O4/PD‑L1单抗修饰纳米颗 粒的制备 方法， 其特 征在于， 包括以下步骤： [0009]（1） 将Fe3O4‑OA （油酸修饰的四氧化三铁磁性纳米颗粒） 与DSPE ‑PEG‑COOH （二硬脂 酰磷脂酰乙醇胺 ‑聚乙二醇 ‑羧基） 、 DPPC超声混合均匀， 得到F e3O4‑DPPC/DSPE‑PEG‑COOH； [0010]如未反应完全 （圆底烧瓶底部存在黑色残留四氧化三铁） ， 添加适当DPPC （磷脂） 重 复上述操作， 直至圆底烧瓶底部反应完全， 即获得Fe3O4‑DPPC/DSPE ‑PEG‑COOH （Fe3O4‑DPPC/ COOH） 。说　明　书 1/7 页 3 CN 115068630 B 3