(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210877007.6 (22)申请日 2022.07.25 (66)本国优先权数据 202210872270.6 202 2.07.20 CN (83)生物保 藏信息 CCTCC M 2013193 2013.0 5.09 CCTCC M 2019517 2019.07.0 3 (71)申请人 黄河科技学院 地址 450005 河南省郑州市二七区航海中 路94号 (72)发明人 郭庆丰　陈林　石磊　王鑫杨　 李丹丹　尹震花　张娟娟　康文艺　 (74)专利代理 机构 郑州联科专利事务所(普通 合伙) 41104 专利代理师 张丽(51)Int.Cl. C07D 209/96(2006.01) C12P 17/16(2006.01) C12P 39/00(2006.01) A61K 31/404(2006.01) A61K 31/282(2006.01) A61K 31/513(2006.01) A61P 35/00(2006.01) C12R 1/07(2006.01) C12R 1/645(2006.01) (54)发明名称 一种球毛壳菌素类化合物的制备方法及应 用 (57)摘要 本发明属于天然产物 化学技术领域， 具体涉 及一种球毛壳菌素类化合物的制备方法及应用。 本发明提供了一种利用马德里毛壳菌与凝结芽 孢杆菌共培养发酵制备球毛壳菌素类化合物的 方法， 所述方法提取工艺简单， 生产成本低， 绿色 环保， 产量高。 本发明还提供了所述球毛壳菌素 类化合物的应用， 以食管鳞癌KYSE ‑30细胞为研 究对象， 采用MTT， western  blot、 高表达或敲低 等实验方法研究了分离得到球毛壳菌素类化合 物的抗食管鳞癌活性， 并探讨其作用机制。 本发 明研究结果表明： 球毛壳菌素类生物碱E作为细 胞焦亡诱导剂， 能够通过降低细胞内PLK 1蛋白表 达水平， 或抑制PLK 1蛋白表达， 促进GSDME蛋白活 化， 从而诱导食管鳞癌KYSE ‑30细胞焦亡， 本发明 对细胞焦亡诱 导剂的开发提供一定的技 术支持。 权利要求书2页 说明书13页 附图8页 CN 115181057 A 2022.10.14 CN 115181057 A 1.一种球毛壳菌素类化 合物， 其特 征在于， 结构式如下： 2.一种利用马德里毛壳菌与凝结芽孢杆菌共培养发酵制备球毛壳菌素类化合物的方 法， 其特征在于， 包括以下步骤： (1)菌种活化、 制备种子液： 将凝结芽孢杆菌接种到LB固体培养基上， 于35 ‑37℃的温度 下培养3～5d， 获得凝结芽孢杆菌活化菌种； 将马德 里毛壳菌接种到平板培养基上， 于25 ‑30 ℃的温度下培养5～7d， 获得马德 里毛壳菌活化菌种； 将 凝结芽孢杆菌活化菌种接种到LB液 体培养基中， 于 35‑37℃的温度下培 养5～7d， 得到种子液； (2)共同培养： 将步骤(1)制备的种子液接种到大米培养基中， 在24～28℃温度下培养5 ～7d， 然后接入马德里毛壳菌活化菌种进行共同培养， 继续发酵培养30 ‑35d， 得固体发酵 物； (3)粗提物制备： 将步骤(2)的固体发酵物经乙酸乙酯浸提， 浓缩， 干燥， 回收乙酸乙酯， 得乙酸乙酯粗 提物； (4)硅胶柱层析： 将步骤(3)制备的粗提物， 经两次硅胶柱层析， 并经薄层层析检测， 合 并相同流份， 得到 十个流分， 按照流分 极性由小到大， 依次编号 为Fr1‑10； (5)化合物纯化： 将步骤(4)制备的流份经重结晶、 葡聚糖凝胶柱层析或硅胶柱层析进 行纯化， 得到所述球毛壳菌素类化 合物。 3.根据权利要求2所述的方法， 其特征在于， 步骤(2)中种子液接种到大米培养基中的 接种量为0.5‑0.8％。 4.根据权利要求2所述的方法， 其特征在于， 所述步骤(4)中两次硅胶柱层析具体步骤 为： 将粗提物与80 ‑100目硅胶拌样， 装柱， 以200～300目减压硅胶柱为固定相， 依次用流动 相I、 流动相II进 行梯度洗脱， 再取部分洗脱液， 浓缩， 干燥， 以200～300目硅胶柱 为固定相， 依次用流动相I、 流动相I I进行二次梯度洗脱； 所述流动相 I是体积比为100:1、 50:1、 20:1、 10:1的石油醚和乙酸乙酯； 所述流动相II 是体积比为10 0:1、 50:1、 20:1、 10:1的二氯甲烷和甲醇。 5.球毛壳菌素类化合物、 或所述球毛壳菌素类化合物联合顺铂或5 ‑氟尿嘧啶在制备抗 肿瘤药物中的应用。 6.根据权利要求5所述的应用， 其特征在于， 所述肿瘤包括人食管癌、 人肺腺癌、 人结直权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 115181057 A 2肠癌、 人乳腺癌、 人肝癌、 人胰腺癌或人胃癌。 7.根据权利要求5所述的应用， 其特征在于， 单独使用球毛壳菌素类化合物时， 球毛壳 菌素类化合物的终浓度为(0.25 ‑20)μM， 处理时间为24 ‑48h时， 能够抑制肿瘤细胞的增殖、 诱导其焦亡或促进其凋亡， 所述肿瘤细胞为人食管癌细胞KYSE ‑30、 KYSE‑150或TE‑1， 或者 人肺癌细胞A549、 人 结肠癌细胞SW620、 人乳腺癌MDA ‑MB‑231。 8.根据权利要求5所述的应用， 其特征在于， 球毛壳菌素类化合物和顺铂或5 ‑氟尿嘧啶 在联合应用时， 球毛壳菌素类化合物和顺铂或5 ‑氟尿嘧啶一次性添加使用或分多次连续添 加使用。 9.根据权利要求8所述的应用， 其特征在于， 当球毛壳菌素类化合物和顺铂或5 ‑氟尿嘧 啶一次性添加使用时， 球毛壳菌素类化合物和顺铂的摩尔比为1： (1 ‑2)， 处理时间为24 ‑ 48h； 或者球毛壳菌素类化 合物和5‑氟尿嘧啶的摩尔比为1： (10 ‑20)， 处理时间为24 ‑48h。 10.一种含有球毛壳菌素类化合物的抗肿瘤药物组合物， 其特征在于， 包括球毛壳菌素 类化合物或其盐， 以及顺铂或5 ‑氟尿嘧啶； 球毛壳菌素类化合物和顺铂的摩尔比为1： (1 ‑ 2)， 球毛壳菌素类化 合物和5‑氟尿嘧啶的摩尔比为1： (10 ‑20)。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 115181057 A 3