(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202211087399.2 (22)申请日 2022.09.07 (71)申请人 福建农林大 学 地址 350002 福建省福州市仓山区上 下店 路15号 (72)发明人 邱君志　朱志强　谭震　刘森　 陈宇熹　蒲慧丽　杨晨杰　陈金慧　 赖芃宇　王玲　 (74)专利代理 机构 福州元创专利商标代理有限 公司 35100 专利代理师 林文弘　蔡学俊 (51)Int.Cl. C12P 33/00(2006.01) C07J 63/00(2006.01) A61P 35/00(2006.01)C12R 1/645(2006.01) (54)发明名称 一种生物活性次级代谢产物的制备方法和 应用 (57)摘要 本发明公开了一种生物活性次级代谢产物 （A'‑Neogammacer ‑17(21)‑en‑15α‑ol） 的制备 方法和应用， 所述真菌为 Raffaelea  lauricola ， 提取方法包括： 菌体活化及培养， 乙酸乙酯萃取 得粗提物， 将粗提物进行多次硅胶 柱层析纯化浓 缩制得。 本发明制备的A' ‑Neogammacer ‑17‑en‑ 15α‑ol对人乳腺癌 细胞MCF‑7、 肝癌细胞HePG2、 肺癌细胞A 549均有明显的抑制增殖效果， 具有 开 发抗肿瘤药物的潜力。 权利要求书1页 说明书4页 附图6页 CN 115323027 A 2022.11.11 CN 115323027 A 1.一种生物活性次级代谢产物的制备 方法， 其特 征在于： 包括以下步骤： 1） 将Raffaelea  lauricola 活化后， 取菌块接种到PDB  培养基中， 在160～180  r/min、 20~28℃条件下连续培养5~10天， 按15wt%~20wt%接种量转接到大米培养基中， 继续在20～ 28℃条件下静置 培养28～40天， 得到 菌丝体； 2） 将步骤1） 得到的菌丝体在35~40℃下干燥后研磨成粉状， 用1~2倍体积乙酸乙酯浸泡 12~24小时， 超声40~60分钟， 收集萃取液， 残渣中再加入菌丝体1~2倍体积的乙酸乙酯， 超声 40~60分钟， 收集萃取 液， 重复以上步骤， 共得到三份萃取 液合并浓 缩得到粗 提物浸膏； 3） 将粗提物浸膏用氯仿 或二氯甲烷溶解， 然后用反相硅胶C18进行拌样， 干法装柱， 以甲 醇： 水自体积比1:9 ‑9:1梯度洗脱， 收集甲醇： 水体积比为9:1部位洗脱液， 旋蒸浓缩得组分 A； 4） 用1倍体积的氯仿溶解组分A， 过200 ‑300目硅胶柱， 石油醚： 乙酸乙酯体积比为30:1 开始梯度洗脱， 收集石油醚： 乙酸乙酯体积比为10:1部分洗脱液， 旋蒸浓缩得浸膏， 再过 200‑300目硅胶柱， 以石油醚： 氯仿体积比为8:1开始梯度洗脱， 收集石油醚:氯仿体积比为 4:1部分洗脱液， 再过200 ‑300目硅胶柱层析， 以石油醚： 乙酸乙酯体积比为20:1开始梯度洗 脱， 收集石油醚： 乙酸乙酯体积比为8:1部分洗脱液， 旋蒸 得到白色粉末状A' ‑Neogammacer ‑ 17‑en‑15α‑ol， 即藿烷型三萜类化 合物。 2.根据权利要求1所述的生物 活性次级代谢产物的制备方法， 其特征在于： 步骤1） 中大 米培养基： 大米10 0 g， 木屑10  g， 加入纯 水120 mL， 121℃高压灭菌20  min。 3.根据权利要求1所述的生物 活性次级代谢产物的制备方法， 其特征在于： 步骤1） 中菌 块的大小为0.5 ×0.5 cm， 接种量 为4块。 4.根据权利要求1所述的生物 活性次级代谢产物的制备方法， 其特征在于： 步骤2） 中超 声的功率 为400 W， 频率为35 KHz。 5.根据权利要求1所述的生物 活性次级代谢产物的制备方法， 其特征在于： 步骤3） 中使 用的反相硅胶C18粒径40‑60 μm， 孔径120   Å。 6.根据权利要求1所述的生物 活性次级代谢产物的制备方法， 其特征在于： 步骤4） 中梯 度洗脱中石油醚： 乙酸乙酯体积比依次为30:1,  20:1, 10:1, 8:1； 石油醚： 氯仿体积比依 次为8:1, 6:1, 4:1。 7.一种如权利要求1 ‑6任一项所述的制备方法制得的生物活性 次级代谢产物在抑制人 乳腺癌细胞M CF‑7、 肝癌细胞HePG2、 肺癌细胞A549增殖的药物中的应用。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115323027 A 2一种生物活性次级代谢产物的制备方 法和应用 技术领域 [0001]本发明属于从微生物分离活性物质的技术领域， 具体涉及 Raffaelea  lauricola 中生物活性次级代谢产物 （A' ‑Neogammacer‑17‑en‑15α‑ol） 制备及应用。 背景技术 [0002]A'‑Neogammacer ‑17(21)‑en‑15α‑ol是一种由五元环构成的藿烷型三萜类物质， 是一种微生物代谢中常见的萜类化合物， 自198 6年荷兰学者van Eijk等在虫生真菌中分离 得到两个三萜物质开始 （Van  Eijk G W, Roeijmans  H J, Seykens D. Hopanoins  from  the entomogenous  fungus aschersonia  aleyrodis . Tetrahedron  Letters, 1986, 27 (22): 2533‑2534. ） ， 藿烷型三萜便受到越来越多的关注， 萜类物质在天然产物中具有重要 地位， 其不仅有良好的稳定性， 抗菌、 抗炎、 抗肿瘤等效果也很显著。 而在 Raffaelea   lauricola （食菌小蠹共生 真菌） 中尚属首次分离到A' ‑Neogammac er‑17‑en‑15α‑ol。 这不仅 丰富了天然产物来源也 为萜类物质的开发利用拓 宽了道路。 发明内容 [0003]本发明的目的是公开一种 Raffaelea  lauricola 中生物活性次级代谢产物 （A' ‑ Neogammacer‑17‑en‑15α‑ol） 制备及应用， 以促进其进一 步在医药 领域的研究和开发。 [0004]为实现上述目的， 本发明采取的技 术方案如下： Raffaelea  lauricola 中生物活性次级代谢产物 （A' ‑Neogammacer ‑17‑en‑15α‑ ol） 的制备 方法， 包括以下步骤： 1)将Raffaelea  lauricola 活化后， 取菌块接种到PDB  培养基中， 在， 在140～180   r/min、 20~28℃条件下连续培养5~10天即初级培养， 按15wt%~20wt%接种量转接到改良的大 米培养基中， 继续在20～ 28℃条件下静置 培养28～40天即次级培 养。 [0005]2） 将步骤1） 得到的菌丝体在室温下干燥后研磨粉碎， 用1~2倍体积的乙酸乙酯浸 泡12~24小时， 超声40~60分钟， 收集萃取液， 残渣中再加入菌丝体1~2倍体积的乙酸乙酯， 超 声40~60分钟， 收集萃取 液， 重复以上步骤， 共得到三份萃取 液合并浓 缩得到粗 提物浸膏。 [0006]3） 将浸膏用氯仿或二氯甲烷溶解， 然后用反相硅胶C18进行拌样， 干法装柱， 以甲 醇： 水自体积比1:9 →9:1梯度洗脱， 收集甲醇： 水体积比为9:1部位洗脱 液， 旋蒸浓缩 得组分 A。 [0007]4） 用1倍体积的氯仿溶解组分A， 上200 ‑300 目硅胶柱， 石油醚： 乙酸乙酯体积比 30:1 开始梯度洗脱， 收集石油醚： 乙酸乙酯体积比10:1  部分洗脱液， 旋蒸浓缩得浸膏， 再 过200‑300目硅胶柱， 以石油醚： 氯仿体积比8:1开始梯度洗脱， 收集石油醚:氯仿体积比4:1 部分洗脱液， 再过200 ‑300目硅胶柱层析， 以石油醚： 乙酸乙酯体积比20:1开始梯度洗脱， 收 集石油醚： 乙酸乙酯体积比8:1部分洗脱液， 旋蒸得到白色粉末状A' ‑Neogammacer ‑17‑en‑ 15α‑ol， 其结构式如下：说　明　书 1/4 页 3 CN 115323027 A 3