(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202211148273.1 (22)申请日 2022.09.21 (71)申请人 上海纳米技 术及应用国家工程研究 中心有限公司 地址 201109 上海市闵行区剑川路468号 (72)发明人 崔大祥　朱竞尧　朱君　徐艳　 徐颖湉　杨迪诚　 (74)专利代理 机构 上海东亚专利商标代理有限 公司 31208 专利代理师 董梅 (51)Int.Cl. A61K 41/00(2020.01) A61K 47/46(2006.01) A61K 47/20(2006.01) A61P 35/00(2006.01)A61K 49/22(2006.01) A61K 49/04(2006.01) (54)发明名称 一种细胞外囊泡装载中空金纳米球的制备 方法 (57)摘要 本发明公开一种细胞外囊泡装载中空金纳 米球的制备方法， 先使用钴模板法制备中空金纳 米球， 并使用巯基聚乙二 醇修饰， 接着， 通过主动 装载法将中空金纳米球装载到细胞外囊泡中获 得一种基于细胞外囊泡的纳米肿瘤诊疗平台， 该 纳米诊疗平台可通过细胞外囊泡的归巢效应实 现在肿瘤组织中的特异性积累， 此外， 包裹在囊 泡内的中空金纳米球在光的激发下能产生热能 消融肿瘤细胞以及产生一系列光学特性用于肿 瘤检测， 实现对肿瘤的诊 疗一体化。 权利要求书1页 说明书5页 CN 115531540 A 2022.12.30 CN 115531540 A 1.一种细胞外囊泡装载中空金纳米球的制备方法， 其特征在于， 先使用钴模板法制备 中空金纳米球， 并使用巯基聚乙二醇修饰， 接着， 通过主动装载法将中空金纳米球装载到细 胞外囊泡中， 至少包括下述 步骤： （1） 中空金纳米球制备： 称取723 mg ‑1.2g的柠檬酸三钠、 52 mg的氯化钴溶于1000 mL 的去离子水中， 氩气鼓泡60 min 去除溶液中的溶解氧， 在氩气保护、 700 rpm磁力搅拌下， 加入新鲜配置的2.5 mL 1M的硼氢化钠， 溶液由淡粉色变为棕色， 说明钴纳米颗粒的形成， 继续氩气鼓泡60 min 使硼氢化钠完全水解； 在另一个三颈烧瓶中配置0.04mM ‑0.1mM 的氯 金酸溶液600 mL， 氩气鼓泡60 min去除溶解氧， 之后将800 mL的钴纳米颗粒迅速加 入至氯 金酸溶液中， 在氩气保护 下静置15 min使金离子充分在钴纳米颗粒表面生长， 再将溶液置 于空气中700 rpm磁力搅拌去除钴模板， 获得中空金纳米球， 15000 rpm离心3次， 去离子水 重悬备用； （2） PEG修饰中空金纳米球： 将PEG2000‑SH与中空金纳米球共混， 孵育 过夜， 离心去除未偶 联的PEG2000； （3） 制备装载中空金纳米球的细胞外囊泡： 将PEG修饰的中空金纳米球溶解于无外泌体 的培养基内配置成200 μg/mL 的溶液， 并将其与细胞在37℃、 5% CO2中共孵育24 h， 提取细 胞培养上清液， 25 00g下离心10mi n取上清， 去除上清中残留的细胞以及 细胞碎片； （4） 纯化： 从步骤 （3） 上清液中提取细胞外囊泡， 获得装载中空金纳米球的细胞外囊泡， 最后纯化外泌体， 去除未经包裹的中空金纳米球， 得到纯化后的装载中空金纳米球的细胞 外囊泡。 2.根据权利要求1所述的细胞外囊泡装载中空金纳米球的制备方法， 其特征在于， 所述 的中空金纳米 球的平均粒径在3 0‑50 nm之间。 3.根据权利要求1所述的细胞外囊泡装载中空金纳米球的制备方法， 其特征在于， 所述 的中空金纳米 球溶液的紫外可 见吸收光谱的吸 收峰在650‑850 nm之间。 4.根据权利要求1所述的细胞外囊泡装载中空金纳米球的制备方法， 其特征在于， 步骤 （3） 所述的细胞包括人或鼠的细胞系或原 代细胞。 5.根据权利要求1所述的一种基于细胞外囊泡的纳米肿瘤诊疗平台的制备方法， 其特 征在于， 步骤 （4） 所述的细胞外囊泡的提取方法包括差速离心法、 色谱法、 超滤法、 免疫磁珠 法、 PEG沉淀法。 6.根据权利要求1所述的一种基于细胞外囊泡的纳米肿瘤诊疗平台的制备方法， 其特 征在于步骤 （4） 所述的细胞外囊泡 提纯方法包括色谱法、 密度梯度离心法、 超滤法。 7.一种细胞外囊泡装载中空金纳米球， 其特征在于， 根据权利要求1至6任一所述方法 制备得到的。 8.一种细胞外囊泡装载中空金纳米球在基于细胞外囊泡的纳米肿瘤诊疗平台中的应 用。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115531540 A 2一种细胞外囊泡装载 中空金纳米球的制备方 法 技术领域 [0001]本发明涉及 一种生物医用材料技术领域的方法， 具体是一种细胞外囊泡装载中空 金纳米球的制备方法， 一种基于细胞外囊泡的仿生纳米肿瘤诊疗平台的制备方法， 将 中空 金纳米球经聚乙二醇链修饰后， 与细胞共孵育， 收集细胞上清并分离提纯细胞外囊泡， 获得 细胞外囊泡装载的中空金纳米 球， 可用于肿瘤的光热治疗与成像。 背景技术 [0002]一直以来， 癌症是人类生命健康的主要威胁之一。 根据世界卫生组织国际癌症研 究机构 （IARC） 发布的2020年全球最新癌症负担数据， 2020年， 中国新发癌症病例457万例， 其中男性248万例， 女性209万例， 癌症死亡病例300万例， 其中男 性182万例， 女性118万例。 临床的传统治疗方式如化疗、 放疗存在一定的局限性， 例如化疗中药物无法准确 地递送到 肿瘤部位且常伴随非特异性的细胞毒性， 对正常细胞造成损害， 导致一系列的不良反应。 而 放疗是局部的疗法， 无法带来全身的治疗效果且副作用较大。 这些都导致了肿瘤治疗的不 彻底， 副作用大等问题。 此外， 癌症的早期筛查诊断对提高患者 生存率具有重要意 义。 [0003]光介导的纳米诊疗学是一种新兴的非侵入式肿瘤诊疗策略， 它将多重癌症检测与 治疗实时监测结合， 有望推动纳米医学领域走向真正的个性化医疗。 金纳米材料作为一种 典型的贵金属纳米诊疗平台近年来被广泛关注， 一方面其可作为优良的光热转换材料实现 肿瘤的光热治疗， 且某些特殊结构如金纳米笼也可作为载体实现药物的靶向递送。 另一方 面金纳米材料也可作为CT成像、 光声成像、 光学相干断层扫描成像的对比剂。 其优势在于： 首先金是化学惰性材料， 生物相容性好， 毒性低， 其次金纳米材料与光相互作用时能发生表 面等离子共振效应， 具有优良的光学性能， 最后金纳米材 料的制备工艺简单， 易于修饰。 [0004]细胞外囊泡是细胞内发生并释放至外环境的小囊泡， 具有生物膜结构。 在维持细 胞内稳态、 分子跨膜运输、 细胞间通讯等方面具有重要作用。 外泌体表面锚定有 供体细胞特 定的膜蛋白且尺 寸介于40 ‑160 nm 之间， 使得其具有可穿透生理屏障、 逃避免疫系统清除、 病变部位聚集能力强等特点， 因此被寄希望成为下一代纳米递药系统。 作为药物载体， 细胞 外囊泡显示出高效的细胞摄取和靶向归巢能力。 [0005]因此本发明将中空金纳米球负载于细胞外囊泡内， 得到一种纳米肿瘤诊疗平台。 利用细胞外囊泡安全 无毒性且肿瘤 靶向能力强的载体特性、  中空金纳米球光吸收特性， 实 现对肿瘤的诊疗一体化。 发明内容 [0006]本发明目的在于提供一种细胞外囊泡装载中空金纳米 球的制备 方法。 [0007]本发明的再一目的在于： 提供 上述方法获得的产品。 [0008]本发明的又一目的在于： 提供 所述产品的应用。 [0009]本发明目的通过以下方案实现： 一种细胞外囊泡装载中空金纳米球的制 备方法， 先使用钴模板 法制备中空金纳米球， 并使用巯基聚乙二醇修饰， 接着， 通过主动装载法将中说　明　书 1/5 页 3 CN 115531540 A 3