(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210926480.9 (22)申请日 2022.08.03 (71)申请人 南京中医药大学 地址 210023 江苏省南京市栖霞区仙林大 道138号 (72)发明人 林炜　赵明　魏勇军　路楚洁　 杜瑞　林兆柱　陈培英　 (74)专利代理 机构 上海申沪专利代理有限公司 31483 专利代理师 赖俊平 (51)Int.Cl. C12P 17/18(2006.01) C12P 17/06(2006.01) C12N 15/81(2006.01) C12N 15/61(2006.01)C12N 15/60(2006.01) C12N 15/54(2006.01) C12N 15/53(2006.01) C12N 15/52(2006.01) C12N 1/19(2006.01) A23L 33/10(2016.01) A61K 31/353(2006.01) A61P 35/00(2006.01) C09K 15/06(2006.01) C12R 1/865(2006.01) (54)发明名称 一种美迪紫檀素的生物合成方法 (57)摘要 本发明公开了一种利用合成生物学技术在 酿酒酵母体内异源合成天然高价值活性化合物 美迪紫檀素的方法， 本发明利用生物信息学分 析、 挖掘， 体内和体外实验鉴定， 验证了美迪紫檀 素生物合成相关的12 个关键酶基因——肉桂酸 ‑ 4‑羟化酶、 香豆酰辅酶A连接酶、 查尔酮合成酶、 查尔酮还原酶、 查尔酮异构酶、 2 ‑羟基异黄酮合 成酶、 2‑羟基异黄酮脱水酶、 异黄酮 ‑4′ ‑O‑甲基 转移酶、 异 黄酮‑2′ ‑羟化酶、 异 黄酮还原酶、 雌激 素还原酶、 紫檀碱合成酶， 以这些关键酶基因作 为美迪紫檀 素的表达元件， 在酿酒酵母细胞工厂 中构建了基因表达模块获取高价值活性化合物 美迪紫檀素。 本发明合成方法经济高效、 绿色环 保， 合成得到的美迪紫檀素纯度高， 具有重要的 应用价值。 权利要求书3页 说明书9页 附图5页 CN 115109809 A 2022.09.27 CN 115109809 A 1.一种美 迪紫檀素的生物合成方法， 其特 征在于， 包括以下步骤： (1)构建酵母菌株DW ‑01， 异甘草素在该酵母菌株中异源表达的查尔酮异构酶作用下可 获得化合物1—甘草素， 结构式如下： (2)构建酵母菌株DW ‑04， 甘草素在 该酵母菌株中异源表达的2 ‑羟基异黄酮合成酶和2 ‑ 羟基异黄酮脱水酶作用下 可获得化 合物2—黄豆苷元， 结构式如下： (3)构建酵母菌株DW ‑07， 黄豆苷元在该酵母菌株中异源表达的异黄酮 ‑4′ ‑O‑甲基转移 酶作用下获得化 合物3—芒柄花黄素， 结构式如下： (4)构建酵母菌株DW ‑02、 DW‑03和DW‑06， 芒柄花黄素在这些酵母菌株中异源表达的异 黄酮‑2′ ‑羟化酶、 异黄酮还原酶、 雌激素还原酶和pterocarpan  synthase作用下获得化合 物美迪紫檀素， 其结构式如下： 2.根据权利要求1所述的一种美迪紫檀素的生物合成方法， 其特征在于， 包括以下步 骤： (1)异甘草素在查尔酮异构酶的催化下异构成甘草素 酶反应体系为： 1M/L缓冲液HEPES15 μL， 10mg/mL底物异甘草素7.7μL， 49.81mg/mL的查 尔酮异构酶30 μL， 超纯水补至300 μL， 混匀； 于水浴锅中反应过夜后， 用乙酸乙酯萃取， 合并 萃取液后离心浓 缩至干， 后加甲醇复溶， 经0.2 2 μm微孔滤膜滤 过， 得甘草素； (2)甘草素在2 ‑羟基异黄酮合成酶(2 ‑HIS)、 2‑羟基异黄酮脱水酶(HID)的催化下生成 黄豆苷元权　利　要　求　书 1/3 页 2 CN 115109809 A 2酶反应体系为： 0.2M  K2HPO4， 1.25mM GSH， 50％蔗糖， 1mM还原型辅酶 Ⅱ(NADPH)组成 的 酶反应液400 μL,10mg/mL底物甘草素2.5 μL， 70mM/L还原型辅酶 Ⅰ(NADH)15 μL， 1M/L的MgCl25 μL， 2‑羟基异黄酮合成酶430 μL和2 ‑羟基异黄酮脱水酶50 μL， 超纯水补至300 μL， 混匀； 于水 浴锅中反应过夜后， 用乙酸乙酯萃 取， 合并萃 取液后离心浓缩至干， 后加甲醇复溶， 经0.22 μ m微孔滤膜滤 过， 得黄豆苷元； (3)黄豆苷元在异黄酮 ‑4′ ‑O‑甲基转移酶(HI 4′OMT)的催化下生成芒柄花黄素 酶反应体系为： pH  7.5， 1M/L的Tris ‑HCl60μL， 55mM/L的β ‑巯基乙醇76μL， 0.5M/L的 EDTA3 μL， 10mM/L的还原型辅酶 Ⅱ(NADPH)30 μL， 10mg/mL的底物黄豆苷元 1.2 μL， 10mM/L的S ‑ 腺苷甲硫氨酸(SAM)14 μL， 异黄酮 ‑4′ ‑O‑甲基转移酶30 μL， 超纯水补至300 μL， 混匀； 于水浴 锅中反应过夜后， 用乙酸乙酯萃取， 合并萃取液后离心浓缩至干， 后加甲醇复溶， 经0.22 μm 微孔滤膜滤 过， 得芒柄花黄素； (4)芒柄花黄素在异黄酮 ‑2′ ‑羟化酶(I2′H5)、 异黄酮还原酶(IFR4)、 雌激素还原酶(VR) 及pterocarpan  synthase(PTS)催化下生成美 迪紫檀素 酶反应体系为： 1M/L的K3PO4100 μL， 2M/L的蔗糖192.5 μL， 1M/L的GSH0.5 μL， 10mM/L的还 原型辅酶 Ⅱ(NADPH)200 μL， 10mM/L的还原型辅酶 Ⅰ(NADH)200 μL， 1M/L的MgCl25 μL， 10mg/mL 底物芒柄花黄素1.2 μL， 粗酶液250 μL， 超纯水补至300 μL； 混匀， 于水浴锅中反应过夜； 芒柄 花黄素能在异黄酮 ‑2′ ‑羟化酶(I2′H5)和异黄酮还原酶(IFR4)生成中间产物vestitone， 继 而中间产物vestitone在 雌激素还原酶(VR)及pteroc arpan synthase(PTS)的催化下生成 美迪紫檀素， 用乙酸乙酯萃取三次， 合并萃取液后离心浓缩至干， 后加甲醇复溶， 经0.22 μm 微孔滤膜滤 过， 得到美迪紫檀素。 3.根据权利要求2所述的一种美迪紫檀素的生物合成方法， 其特征在于， 包括以下步 骤： (1)异甘草素在查尔酮异构酶的催化下异构成甘草素 300μL酶反应体系为： 1M/L缓冲液HEPES  15μL， 10mg/mL的底物异甘草素7.7μL，权　利　要　求　书 2/3 页 3 CN 115109809 A 3