(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210970752.5 (22)申请日 2022.08.13 (71)申请人 上海纳米技 术及应用国家工程研究 中心有限公司 地址 201109 上海市闵行区剑川路468号 (72)发明人 崔大祥　朱竞尧　 (74)专利代理 机构 上海东亚专利商标代理有限 公司 31208 专利代理师 董梅 (51)Int.Cl. A61K 41/00(2020.01) A61K 9/51(2006.01) A61K 47/64(2017.01) A61K 47/46(2006.01) A61K 49/04(2006.01)A61K 49/22(2006.01) A61P 35/00(2006.01) B82Y 5/00(2011.01) (54)发明名称 一种肿瘤细胞外泌体装载金纳米颗粒的制 备方法及其产品和应用 (57)摘要 本发明涉及一种肿瘤细胞外泌体装载金纳 米颗粒的制备方法及其产品和应用， 其制备方 法： 采用经典柠檬酸还原法制备获得金纳米颗 粒， 再通过巯基( ‑SH)与金纳米颗粒相互作用， 实 现细胞穿膜肽Cys ‑TAT对金纳米颗粒的表面修 饰， 取适量的该纳米颗粒与肿瘤细胞共孵育， 收 集细胞上清 提取外泌体， 获得最终的肿瘤细胞外 泌体装载金纳米颗粒。 可用于肿瘤靶向的纳米诊 疗平台。 肿瘤细胞外泌体具有 生物膜结构且表达 CD47配体， CD47与抑制性免疫受体SIRPα结合后 产生“别吃我”信号， 利用外泌体的这一特性， 增 强了在诊疗平台的血液循环时间。 利用外泌体良 好的归巢性， 实现纳米药物向肿瘤组织靶向递 送， 提升了金纳米 颗粒的装载效率。 权利要求书2页 说明书5页 CN 115364212 A 2022.11.22 CN 115364212 A 1.一种肿瘤细胞外泌体装载金纳米颗粒的制备方法， 其特征在于， 采用柠檬酸还原法 制备金纳米颗粒， 再通过巯基( ‑SH)与金纳米颗粒相互作用， 实现细胞穿膜肽Cys ‑TAT对金 纳米颗粒的表面修饰， 取适量的该纳米颗粒与肿瘤细胞共孵育， 收集细胞上清 提取外泌体， 获得最终的肿瘤靶向的纳米颗粒， 包 含以下步骤： （1） 金纳米颗粒制备： 将HAuCl4加入Milli ‑Q水中形成HAuCl4溶液并加热煮沸5  min， 然 后向溶液中加入柠檬酸钠溶液， 混合物持续煮沸30  min， 直到溶液变成红色， 然后将反应体 系冷却到室温， 终止反应， 获得 金纳米颗粒； （2） 利用离心式过滤器过滤， 去除金纳米颗粒表面残留的物质， 将200  μL 1mM的Cys ‑ TAT加入至1mL 0.5mM的金纳米颗粒溶液中， 在室温下缓慢搅拌24  h， 离心去除未反应的试 剂， 得到TAT 多肽修饰的金纳米颗粒； （3） 将TAT多肽修饰的金纳米颗粒溶解于无外泌体培养基内， 配置成200  μg/mL的溶液， 并将其与人肿瘤 细胞系在37℃、 5%  CO2条件下共孵 育48 h； （4） 提取细 胞培养上清， 2500  g下离心10  min取上清， 去除上清中残留的细胞以及细 胞 碎片， 后提取上清液中的外泌体， 用PBS重悬并清洗沉淀物， 获得装载金纳米颗粒的肿瘤细 胞外泌体； （5） 纯化外泌体， 去除未被装载的金纳米颗粒， 得到肿瘤靶向的纳米颗粒。 2.根据权利要求1所述肿瘤细胞外泌体装载金纳米颗粒的制备方法， 其特征在于， 步骤 （1） 所述金的纳米粒的粒径为10 ‑30 nm之间。 3.根据权利要求1所述肿瘤细胞外泌体装载金纳米颗粒的制备方法， 其特征在于， 步骤 （3） 所述的人肿瘤 细胞系包括H CT116、 A549、 HepG2、 HeLa、 Sk ov‑3。 4.根据权利要求1所述肿瘤细胞外泌体装载金纳米颗粒的制备方法， 其特征在于， 步骤 （4） 所述的外泌体提取方法包括超速离心法、 基于PE G的试剂盒法、 尺寸排阻色谱柱法、 超 滤 法和/或免疫磁珠法。 5.根据权利要求1至4任项所述肿瘤细胞外泌体装载金纳米颗粒的制备方法， 其特征在 于， 按以下步骤制备： （1） 金纳米颗粒制备： 将HAuCl4加入Milli‑Q水中形成0.006  wt% HAuCl4溶液并加热煮 沸5 min， 然后向溶液中加 入3mL 1wt%的柠檬酸钠溶液， 混合物持续煮沸30  min， 直到溶液 变成红色， 然后将反应体系冷却到室温， 终止反应， 获得金纳米颗粒， 所得的金纳米颗粒储 存于4℃用于进一 步实验； （2） 利用离心式过滤器A micon Ultra‑15 100 kDa过滤金纳米颗粒， 去除其表面残留的 物质， 将200  μL 1mM的Cys ‑TAT加入至1mL  0.5mM的金纳米颗粒溶液中， 在室温下缓慢搅拌 24 h， 离心去除未反应的试剂， 得到TAT 多肽修饰的金纳米颗粒； （3） 将TAT多肽修饰的金纳米颗粒溶解于无外泌体培养基内， 配置成200  μg/mL的溶液， 并将其与H CT116人结直肠癌细胞在37℃、 5%  CO2条件下共孵 育； （4） 48 h后收集细胞培养上清， 2500  g下离心10  min去除上清中残留的细胞以及细胞 碎片， 再经30000  g离心30 min弃上清， 提取上清液中的外泌体， 用PBS重悬并清洗沉淀物， 获得装载 金纳米颗粒的肿瘤 细胞外泌体； （5） 使用密度梯度离心法纯化外泌体， 去除未被装载的金纳米颗粒， 获得装载金纳米颗 粒的肿瘤 细胞外泌体， 即肿瘤靶向的金纳米颗粒。权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 115364212 A 26.根据权利要求1至4任项所述肿瘤细胞外泌体装载金纳米颗粒的制备方法， 其特征在 于， 按以下步骤制备： （1） 制备 金纳米颗粒； （2） 制备TAT 多肽修饰的金纳米颗粒； （3） 将上述TAT多肽修饰的金纳米颗粒溶解于无外泌体培养基内配置成200  μg/mL的溶 液， 并将其与A549人非小细胞肺癌细胞共孵 育 （37℃， 5%  CO2） ； （4） 48 h后收集细胞培养上清， 2500  g下离心10  min， 去除上清中残留的细胞以及细胞 碎片， 再经30000  g离心30 min弃上清， 用PBS重悬并清洗沉淀， 获得装载金纳米颗粒的肿瘤 细胞外泌体； （5） 使用密度梯度离心法纯化外泌体， 去除未经包裹的金纳米颗粒， 获得装载金纳米颗 粒的肿瘤 细胞外泌体。 7.根据权利要求1至4任项所述肿瘤细胞外泌体装载金纳米颗粒的制备方法， 其特征在 于， 按以下步骤制备： （1） 制备 金纳米颗粒； （2） 制备TAT 多肽修饰的金纳米颗粒； （3） 将上述TAT多肽修饰的金纳米颗粒溶解于无外泌体培养基内配置成200  μg/mL的溶 液， 并将其与A549人非小细胞肺癌细胞共孵 育 （37℃， 5%  CO2） ； （4） 48 h后收集细胞培养上清， 2500  g下离心10  min， 去除上清中残留的细胞以及细胞 碎片， 再经尺 寸排阻色谱柱 （qEV10） 分离外泌体； 同时， 去除未经外泌体包裹的金纳米颗粒， 获得装载 金纳米颗粒的肿瘤 细胞外泌体。 8.根据权利要求1至4任项所述肿瘤细胞外泌体装载金纳米颗粒的制备方法， 其特征在 于， 按以下步骤制备： （1） 制备 金纳米颗粒； （2） 制备TAT 多肽修饰的金纳米颗粒； （3） 将上述TAT多肽修饰的金纳米颗粒溶解于无外泌体培养基内配置成200  μg/mL的溶 液， 并将其与HepG2肝癌细胞共孵 育 （37℃， 5%  CO2） （4） 48 h后收集细胞培养上清， 2500  g下离心10  min， 去除上清中残留的细胞以及细胞 碎片， 再经30000  g离心30 min弃上清， 用PBS重悬并清洗沉淀， 获得装载金纳米颗粒的肿瘤 细胞外泌体； （5） 使用密度梯度离心结合尺寸排阻色谱柱 （qEV 10） 纯化外泌体， 去除未经包裹的金纳 米颗粒。 9.一种肿瘤细胞外泌体装载金纳米颗粒， 根据权利要求1至8任项所述的制备方法得到 的。 10.一种肿瘤 细胞外泌体装载 金纳米颗粒在肿瘤靶向的纳米诊疗平台上的应用。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 115364212 A 3