(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210974483.X (22)申请日 2022.08.15 (71)申请人 呈诺再生医学 科技 （北京） 有限公司 地址 102600 北京市大兴区经济技 术开发 区科创十三 街18号院13号楼3层3 02 (72)发明人 龚士欣　顾雨春　李楠　蒋明月　 曹文华　彭钦清　吴理达　 (74)专利代理 机构 北京轻创知识产权代理有限 公司 11212 专利代理师 孟仕杰 (51)Int.Cl. C12N 5/0786(2010.01) C12N 5/074(2010.01) A61K 35/15(2015.01) A61P 1/00(2006.01)A61P 3/10(2006.01) A61P 7/00(2006.01) A61P 19/02(2006.01) A61P 21/04(2006.01) A61P 25/00(2006.01) A61P 35/00(2006.01) A61P 35/02(2006.01) A61P 37/02(2006.01) (54)发明名称 一种诱导iPSC分化获得巨噬细胞的培养基、 方法及其应用 (57)摘要 本发明涉及一种诱导iPSC分化获得巨噬细 胞的培养基、 方法及其应用， 涉及生物医药技术 领域， 包括第一阶段培养基至第六阶段培养基； 所述第一阶段培养基为含有ROCK通路抑制剂和 聚乙烯醇的E8完全培养基， 所述第二阶段培养基 为含有GSK ‑3β抑制剂的E8完全培养基， 第三阶 段培养基包括M1培养基和M2 培养基， 所述第四阶 段培养基为M3培养基， 所述第五阶段培养基为M4 培养基， 所述第六阶段为M5培养基。 通过优化培 养方式和培养条件， 提高巨噬细胞产量， 并且降 低培养成本， 1个iPSC约可获得18.8万个巨噬细 胞， 且获得的巨噬细胞具有良好的吞噬功能。 权利要求书3页 说明书13页 附图5页 CN 115433715 A 2022.12.06 CN 115433715 A 1.一种诱导iPSC分化获得巨噬细胞的培养基， 其特征在于， 包括第 一阶段培养基、 第二 阶段培养基、 第三阶段培 养基、 第四阶段培 养基、 第五阶段培 养基和第六阶段培 养基； 所述第一阶段培养基为含有ROCK通路抑制剂和聚乙烯醇的E8完全培养基， 所述第二阶 段培养基为含有GSK ‑3β抑制剂的E8完全培养基， 第三阶段培养基包括M1培养基和M2培养 基， 所述第四阶段培养基为M3培养基， 所述第五阶段培养基为M4培养基， 所述第六阶段为M5 培养基； 所述M1培养基包括stempro ‑34完全培养基、 DMEM/F12、 L ‑谷氨酰胺、 抗坏血酸、 Insulin‑Transferrin ‑Selenium ‑Ethanolamine、 BMP4、 VEGF和bFGF， 所述M2培养基包括M1 培养基和TGF ‑β I型受体ALK5、 ALK4和ALK 7的抑制剂； 所述M3培养基包括X ‑VIVOTM 15、 L‑谷氨酰胺、 抗坏血酸、 Insulin ‑Transferrin ‑ Selenium‑Ethanolamine、 NEAA、 β‑巯基乙醇、 BMP4、 VEGF、 bFGF、 SCF、 I L‑3和M‑CSF； 所述M4培养基包括X ‑VIVOTM 15、 L‑谷氨酰胺、 抗坏血酸、 Insulin ‑Transferrin ‑ Selenium‑Ethanolamine、 NEAA、 β‑巯基乙醇、 I L‑3和M‑CSF； 所述M5培养基包括X ‑VIVOTM 15、 L‑谷氨酰胺、 抗坏血酸、 Insulin ‑Transferrin ‑ Selenium‑Ethanolamine、 NEAA、 β‑巯基乙醇和M ‑CSF。 2.根据权利要求1所述一种诱导iPSC分化获得巨噬细胞的培养基， 其特征在于， 所述第 一阶段培养基中的ROCK通路抑制剂选自Y ‑27632、 Thiazovivin、 Fasudil(HA ‑1077)HCl、 GSK429286A、 RKI ‑1447和Azaindole  1中的任意一种； 优选地， 所述ROCK通路抑制剂为Y ‑ 27632； 所述第二阶段培养基中的GSK ‑3β抑制剂选自CHIR ‑99021、 SB216763、 CHIR ‑98014、 TWS119、 Tideglusib和SB415286中的任意 一种； 优选地， 所述GSK ‑3β 抑制剂为C HIR‑99021； 所述M2培养基中的TGF ‑βI型受体ALK5， ALK4和ALK7的抑制剂选自SB431542、 Galunisertib(LY21572 99)、 LY2109761、 SB525 334、 SB505124和GW78 8388中的任意 一种。 3.根据权利要求2所述 一种诱导iPSC分化获得巨噬细胞的培 养基， 其特 征在于， 所述Y‑27632的浓度为0.5 ‑20uM， 优选地， 所述Y ‑27632的浓度为10uM， 所述聚 乙烯醇浓 度为4mg/mL； 所述CHIR‑99021的浓度为1 ‑10 μM， 优选地， 所述C HIR‑99021的浓度为10 μM； 所述第三阶段培养基中， 所述M1培养基包括50wt％stempro ‑34完全培养、 50wt％DMEM/ F12、 1wt％L ‑谷氨酰胺、 50μg/mL抗坏血酸、 1 ×Insulin ‑Transferrin ‑Selenium ‑ Ethanolamine、 50 μg/mL  BMP4、 50 μg/mL  VEGF和50 μg/mL  bFGF组成， 所述M2 培养基包 括M1培 养基和1‑9 μM SB431542； 优选地， 所述SB431542的浓度为6 μM； 所述第四阶段培养基中， 所述M3培养基包括X ‑VIVOTM 15、 1wt％L ‑谷氨酰胺、 50μg/mL 抗坏血酸、 1 ×Insulin‑Transferrin ‑Selenium ‑Ethanolamine、 1 ×NEAA、 55 μMβ ‑巯基乙醇、 50 μg/mL BMP4、 50 μg/mL  VEGF、 50 μg/mL  bFGF、 50 μg/mL  SCF、 25 μg/mL  IL‑3和100 μg/mL  M‑ CSF； 所述第五阶段培养基中， 所述M4培养基包括X ‑VIVOTM 15、 1wt％L ‑谷氨酰胺、 50μg/mL 抗坏血酸、 1 ×Insulin‑Transferrin ‑Selenium ‑Ethanolamine、 1 ×NEAA、 55 μMβ ‑巯基乙醇、 25 μg/mL IL‑3和100 μg/mL M‑CSF； 所述第六阶段培养基中， 所述M5培养基包括X ‑VIVOTM 15、 1wt％L ‑谷氨酰胺、 50μg/mL权　利　要　求　书 1/3 页 2 CN 115433715 A 2抗坏血酸、 1 ×Insulin‑Transferrin ‑Selenium ‑Ethanolamine、 1×NEAA、 55 μMβ ‑巯基乙醇 和100 μg/mL M‑CSF。 4.根据权利要求1所述一种诱导iPSC分化获得巨噬细胞的培养基， 其特征在于， 还包括 第七阶段培 养基， 所述第七阶段培 养基包括M 6培养基或M7培 养基； 所述M6培养基包括X ‑VIVOTM 15、 1wt％L ‑谷氨酰胺、 50μg/mL抗坏血酸、 1 ×Insulin‑ Transferrin ‑Selenium ‑Ethanolamine、 1 ×NEAA、 55 μMβ ‑巯基乙醇、 20 μg/mL  IFN‑γ和50 μ g/mL LPS； 所述M7培养基包括X ‑VIVOTM 15、 1wt％L ‑谷氨酰胺、 50μg/mL抗坏血酸、 1 ×Insulin‑ Transferrin ‑Selenium ‑Ethanolamine、 1 ×NEAA、 55 μMβ ‑巯基乙醇、 20 μg/mL  IL‑4和20 μg/ mL IL‑13。 5.一种诱导iPSC分化获得巨噬细胞的试剂盒， 其特征在于， 包括权利要求1 ‑3任一项所 述的第一 阶段培养基至第六阶段培养基， 或包括权利要求4所述的第一 阶段培养基至第七 阶段培养基。 6.一种诱 导iPSC分化获得巨噬细胞的方法， 其特 征在于， 包括如下步骤： S1： 第一阶段， 拟胚体的形成： 在常氧条件下， 采用如权利 要求1‑3中任一项所述的第一 阶段培养基对iP SC进行悬浮培养1天， 形成拟胚 体； S2： 第二阶段， 拟胚体向中胚层分化： 在缺氧条件下， 采用权利 要求1‑3中任一项所述的 第二阶段培 养基对所述拟胚 体进行诱 导分化培 养1天， 形成中胚层 细胞； S3： 第三阶段， 中胚层细胞向生血内皮细胞分化： 在缺氧条件下， 采用如权利要求1 ‑3中 任一项所述的第三阶段培 养基对所述中胚层 细胞进行诱 导培养3天， 形成生血内皮细胞； 第三阶段的前1天采用如权利要求1 ‑3中任一项 的所述M1培养基对所述中胚层细胞进 行诱导培养， 第三阶段的后两天采用如权利要求1 ‑3中任一项所述的M2培养基替换M1培养 基继续诱导培养； S4： 第四阶段， 生血内皮细胞向髓系祖细胞分化： 在常氧条件下， 采用如权利要求1 ‑3中 任一项所述的第四 阶段培养基， 在有基质胶包被