(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202211085054.3 (22)申请日 2022.09.06 (71)申请人 浙江大学 地址 310058 浙江省杭州市西湖区余杭塘 路866号 (72)发明人 朱佩佩　周成　傅译可　李翔　 (74)专利代理 机构 杭州求是专利事务所有限公 司 33200 专利代理师 邱启旺 (51)Int.Cl. A61K 35/74(2015.01) A61K 9/10(2006.01) A61K 47/46(2006.01) A61K 33/30(2006.01) A61P 35/00(2006.01)A61P 37/04(2006.01) C01G 9/00(2006.01) (54)发明名称 一种锌铝类水滑石-痤疮丙酸杆菌细菌杂化 材料及其制备方法、 应用 (57)摘要 本发明公开了一种锌铝类水滑石 ‑痤疮丙酸 杆菌细菌杂化材料及其制备方法、 应用， 涉及肿 瘤治疗领域， 该方法是通过共沉淀法制备锌铝类 水滑石， 厌氧培养痤疮丙酸杆菌获得分散在去离 子水中的菌液； 锌铝类水滑石水溶液与菌液按比 例混合、 振荡、 离心、 重悬获得杂化材料。 该杂化 材料通过细菌代谢和免疫以及与纳米材料的协 同实现对肿瘤的清除， 解决单一治疗途径效果局 限的难题。 本发明中细菌杂化材料合成简单， 细 菌的厌氧特性使材料能够深入肿瘤组织低氧内 部， 并代谢产生具有杀伤作用的一氧化氮， 同时 促进锌铝类水滑石降解释放锌离子， 锌离子与一 氧化氮进一步打破肿瘤细胞内氧化还原平衡， 促 进细胞凋亡； 细菌同时激活免疫反应， 最终实现 对肿瘤协同杀伤。 权利要求书1页 说明书7页 附图6页 CN 115317520 A 2022.11.11 CN 115317520 A 1.一种锌铝类水滑石 ‑痤疮丙酸杆菌细菌杂化材料的制备方法， 其特征在于， 该方法包 括如下步骤： (1)将去离子水煮沸去除二氧化碳后冷却至室温； 将六水硝酸锌和九水硝酸铝溶于去 离子水中， 得到的锌铝溶液， 所述锌铝溶液中的六水硝酸锌和九水硝酸铝的浓度分别为 0.3M和0.1M； 将硝酸钠溶于去离子水得到0.2M的硝酸钠溶液， 并使用0.8M的氢氧化钠溶液 将硝酸钠溶液的pH调至9.5 ‑10； 将锌铝溶液逐滴加入硝酸钠溶液中， 所述锌铝溶液与硝酸 钠溶液的体积比为2:3， 同时以800 ‑1200rpm搅拌下滴加0.8M的氢氧化钠溶液维持pH在9.5 ‑ 10， 得到混合溶液， 将混合溶液转移至水热釜中80℃反应16 ‑24小时得到锌铝类水滑石晶 体； 重复三次超声和离心， 过 滤得到锌铝类水滑石水 溶液； (2)将存放于 ‑80℃下的含25％ ‑30％甘油的痤疮丙酸杆菌冻存液取出， 在35 ‑38℃水浴 解冻后， 将其在 厌氧超净工作台中加入 液体培养基， 置于35 ‑38℃的摇床中， 复苏40 ‑50小时 后， 4000‑5000rpm离心5‑10分钟， 去离子水清洗一次； 再次4000 ‑5000rpm离心5‑10分钟， 分 散在去离 子水中即得到 痤疮丙酸杆菌分散液； (3)将步骤(1)得到的锌铝类水滑石水溶液和步骤(2)得到的痤疮丙酸杆菌分散液以50 μg/mL和15x107 CFU/mL的比例混合得到混合液， 所述混合液置于温度35 ‑38℃下摇床中1 ‑2 小时； 将混合液在4000 ‑5000rpm下离心5 ‑10分钟， 去离子水重悬得到锌铝类水滑石 ‑痤疮丙 酸杆菌细菌杂化材 料。 2.根据权利要求1所述的一种锌铝类水滑石 ‑痤疮丙酸杆菌细菌杂化材料的制备方法， 其特征在于， 所述 步骤(1)中滴加0.8M的氢 氧化钠溶 液维持碱性， 其pH控制为9.5 ‑10。 3.根据权利要求1所述的一种锌铝类水滑石 ‑痤疮丙酸杆菌细菌杂化材料的制备方法， 其特征在于， 所述步骤(1)中重复三次超声和离心， 具体为， 以频率为9.5 ‑20.5Hz下超声2 ‑4 分钟， 再以10 000‑12000rpm离心5 ‑10分钟， 重复三次此 过程。 4.根据权利要求1所述的一种锌铝类水滑石 ‑痤疮丙酸杆菌细菌杂化材料的制备方法， 其特征在于， 所述步骤(2)中在无氧超净工作台中加入液体培养基； 培养需要使用厌 氧反应 包和密封袋， 以确保无 氧环境。 5.根据权利要求1所述的一种锌铝类水滑石 ‑痤疮丙酸杆菌细菌杂化材料的制备方法， 其特征在于， 所述 步骤(2)中所述摇床的旋转速率 为150‑180rpm。 6.一种由权利要求1 ‑5任一项所述的制备方法得到的锌铝类水滑石 ‑痤疮丙酸杆菌细 菌杂化材 料。 7.根据权利要求6所述的锌铝类水滑石 ‑痤疮丙酸杆菌细菌杂化材料在肿瘤一氧化氮 杀伤、 锌离 子稳态失衡和免疫 治疗剂中的应用。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115317520 A 2一种锌铝类水滑石 ‑痤疮丙酸杆菌细菌杂化材料及其制备方 法、 应用 技术领域 [0001]本申请涉及微生物杂化材料领域， 尤其涉及一种锌铝类水滑石 ‑痤疮丙酸杆菌细 菌杂化材 料及其制备 方法、 应用。 背景技术 [0002]癌症是当前全球共同面对的持续性公共卫生挑战， 全球范围内， 癌症所带来的负 担正在逐渐加重。 很多对癌症患者的化疗、 放疗、 免疫疗法等传统治疗手段普适性低、 副作 用强、 容易产生抗药性， 导致临床治疗效果不甚理想。 由于癌症发病机制复杂， 癌细胞具有 异质性， 很难实现对肿瘤的普遍性、 特异 性和全面性清除。 因此， 开 发出安全、 高效的新型肿 瘤治疗手段符合肿瘤诊 治研究的迫切需求。 [0003]细菌疗法的发展可以追溯到 19世纪。 近年来， 沙门氏菌、 李斯特菌等已经进入肿瘤 治疗的临床试验阶段。 但是， 细菌的安全性、 可控性以及有效性等问题， 限制了肿瘤细菌疗 法的进一步推广。 另外细菌单药治疗面临着效果参差、 有限的困境。 因此， 开发出优秀的治 疗菌种， 并且与其 他治疗手段相结合， 将进一 步推动细菌治疗的发展。 [0004]近几年， 许多研究将细菌与纳米材料相 结合， 利用细菌 的靶向定植能力和杀伤性 代谢产物， 进一步提高抗肿瘤效率。 设计和构建新的微生物杂化材料体系， 细菌和纳米材料 彼此补足缺陷， 增强肿瘤治疗效果的技 术具有强大的发展前 景。 发明内容 [0005]针对现有技术的不足， 本发明提供一种锌铝类水滑石 ‑痤疮丙酸杆菌细菌杂化材 料及其制备方法、 应用， 以解决细菌和纳米材料单独使用的局限， 实现协同杀伤肿瘤的功 效。 [0006]根据本申请实施例的第一方面， 提供一种锌铝类水滑石 ‑痤疮丙酸杆菌细菌杂化 材料的制备 方法， 该方法包括如下步骤： [0007](1)将去离子水煮沸去除二氧化碳后冷却至室温； 将六水硝酸锌和九水硝酸铝溶 于去离子水中， 得到的锌铝溶液， 所述锌铝溶液中的六水硝酸锌和九水硝酸铝的浓度分别 为0.3M和0.1M； 将硝酸钠溶于去离子水得到0.2M的硝酸钠溶液， 并使用0.8M的氢氧化钠溶 液将硝酸钠溶液的pH调至9.5 ‑10； 将锌铝溶液逐滴加入硝酸钠溶液中， 所述锌铝溶液与硝 酸钠溶液的体积比为2:3， 同时以  800‑1200rpm搅拌下滴加0.8M的氢氧化钠溶液维持碱性， 得到混合溶液， 将混合溶液转移至水热釜中8 0℃反应16 ‑24小时得到锌铝类水滑石晶体； 重 复三次超声和离心， 过 滤得到锌铝类水滑石水 溶液； [0008](2)将存放于 ‑80℃下的含25％ ‑30％甘油的痤疮丙酸杆菌冻存液取出， 在  35‑38 ℃水浴解冻后， 将其在 厌氧超净工作台中加入 液体培养基， 置于35 ‑38℃的摇床中， 复苏40 ‑ 50小时后， 4000 ‑5000rpm离心5 ‑10分钟， 去离子 水清洗一次； 再次4000 ‑5000rpm离心 5‑10分 钟， 分散在去离 子水中即得到 痤疮丙酸杆菌分散液；说　明　书 1/7 页 3 CN 115317520 A 3