(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202211175137.1 (22)申请日 2022.09.26 (71)申请人 广东金专生物科技有限公司 地址 510000 广东省广州市南沙区珠 江街 南江二路6号自编9栋 （8#楼） 9层911 （仅限办公） (72)发明人 陈风辉　 (74)专利代理 机构 北京深川专利代理事务所 (普通合伙) 16058 专利代理师 张娴 (51)Int.Cl. A61K 39/00(2006.01) A61P 35/00(2006.01) C12N 5/0786(2010.01) C12N 5/078(2010.01) (54)发明名称 一种非特异性免疫细胞肿瘤疫苗的制备方 法 (57)摘要 本发明公开了一种非特异性免疫细胞肿瘤 疫苗的制备方法。 本发明涉及肿瘤疫苗技术领 域， 具体提供了一种非特异性免疫细胞肿瘤疫苗 的制备方法， 以具有抗肿瘤能力者的外周血作为 免疫细胞的提取基础， 简易高效的提取了具有高 免疫功能的免疫细胞， 免疫细胞在多代培养中分 化并分泌多种具有肿瘤免疫功能的细胞因子， 从 而得到具有非特异性免疫细胞肿瘤疫苗。 权利要求书1页 说明书3页 CN 115501332 A 2022.12.23 CN 115501332 A 1.一种非特异性免疫细胞肿瘤疫苗的制备方法， 其特征在于， 非特异性免疫细胞肿瘤 疫苗的制备 方法， 具体包括下列步骤： 步骤一、 根据抗肿瘤能力指标从健康群 体中筛选具有抗肿瘤能力者； 步骤二、 从所述具有抗肿瘤能力者采集外周血， 并采用生理盐水对抗肿瘤能力者的外 周血进行稀释， 用淋巴细胞分离液分离外周血单核细胞， 采用淋巴细胞培养液A IM‑V调节外 周血单核细胞的密度成3 ×106～5×106/ml的细胞 悬液； 步骤三、 将细胞悬浮液置入3 7℃、 5％CO2的培养箱温育2小时， 然后用移液管轻轻冲吸细 胞之后置入离心机中， 在离心速度为2000rpm 的条件下离心， 离心之后的上清液A移入培养 瓶中， 继续置入37℃、 5％CO2的培养箱温育24小时； 步骤四、 从培育箱中温育24小时的上清液A中分离一代免疫细胞， 并将一代免疫细胞进 行破碎， 离心之后收集上清液B， 上清液B即为 一代免疫细胞的粗 提物； 步骤五、 将一代免疫细胞的粗提物移入培养瓶中， 并向培养瓶中加入CD3单克隆抗体， 继续培养2～3天后得到二代免疫细胞， 在显微镜下对二代免疫细胞计数； 步骤六、 采用CIK细胞培养液将 二代免疫细胞的密度调整至3 ×105～5×105/ml， 之后置 入培养瓶中扩大培 养， 培养瓶中加入细胞裂解液， 培 养2～3天， 即可 得到三代免疫细胞； 步骤七、 从三代免疫细胞培 养物分离免疫细胞， 留下 无细胞培 养液待用； 步骤八、 破碎三代免疫细胞， 离心后收集上清液C， 将上清夜C与无细胞培养液混合， 得 到三代免疫细胞的细胞粗 提物； 步骤九、 通过饱和硫酸铵沉淀法从三代免疫细胞中提取蛋白质， 得到蛋白粗 提物； 步骤十、 将蛋白粗 提物冻干， 即可 得到非特异性免疫细胞肿瘤疫苗的制备 方法。 2.根据权利要求1所述的一种非特异性免疫细胞肿瘤疫苗的制备方法， 其特征在于， 步 骤一所述具有抗肿瘤能力者的指标包括： 身高、 体重、 血压、 脉率、 心肺功能、 血常规、 尿常 规、 血糖、 肝肾功能、 胸片、 心电图、 彩超、 既往史、 家族史、 肿瘤易感基因检测和免疫功能检 测。 3.根据权利要求1所述的一种非特异性免疫细胞肿瘤疫苗的制备方法， 其特征在于， 所 述生理盐水与外周血的体积比为1： 1。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115501332 A 2一种非特异性免疫细胞肿瘤疫苗的制备方 法 技术领域 [0001]本发明涉及肿瘤疫苗技术领域， 具体为一种非特异性免疫细胞肿瘤疫苗的制备方 法。 背景技术 [0002]肿瘤的发生一方面与环境污染、 生活习惯有着密切 关系， 另一方面我国的肿瘤防 治工作也一直存在重治轻防的问题， 肿瘤的预防保健教育未能广泛开展， 或者仅存在于喊 口号阶段， 没有实际行动。 公众对于肿瘤的预防保健认识 不够， 或者不知如何进 行肿瘤的预 防保健。 由此 可见， 对肿瘤的预防保健措施的细化将成为肿瘤防治工作的重点。 [0003]肿瘤疫苗作为肿瘤的防治手段， 是近年研究的热点之一， 其原理将肿瘤抗原以多 种形式如： 肿瘤细胞、 肿瘤相关蛋白或多肽、 表达肿瘤抗原的基因等， 导入患者体内， 克服肿 瘤引起的免疫抑制状态， 增强免疫原 性， 激活患者自身的免疫系统， 诱导机体细胞免疫和体 液免疫应答， 从而达 到控制或清除肿瘤的目的。 [0004]因此， 本方案旨在提供一种新的非特异性免疫细胞肿瘤疫苗的制备 方法。 发明内容 [0005]针对上述情况， 为弥补上述现有缺陷， 本发明提供了一种 非特异性免疫细胞肿瘤 疫苗的制备 方法。 [0006]本发明提供如下的技术方案： 本发明提出的一种非特异性免疫细胞肿瘤疫苗的制 备方法， 具体包括下列步骤： [0007]步骤一、 根据抗肿瘤能力指标从健康群 体中筛选具有抗肿瘤能力者； [0008]步骤二、 从所述具有抗肿瘤 能力者采集外周血， 并采用生理盐水对抗肿瘤 能力者 的外周血进 行稀释， 用淋巴细胞分离液分离外周血单核细胞， 采用淋巴细胞培养液A IM‑V调 节外周血 单核细胞的密度成3 ×106～5×106/ml的细胞 悬液； [0009]步骤三、 将细胞悬浮液置入37℃、 5％CO2的培养箱温育2小时， 然后用移液管轻轻 冲吸细胞之后置入离心机中， 在离心速度为2000rpm 的条件下离心， 离心之后的上清液A移 入培养瓶中， 继续置入37℃、 5％CO2的培养箱温育24小时； [0010]步骤四、 从培育箱中温育24小时的上清液A中分离一代免疫细胞， 并将一代免疫细 胞进行破碎， 离心之后收集上清液B， 上清液B即为 一代免疫细胞的粗 提物； [0011]步骤五、 将一代免疫细胞的粗提物移入培养瓶中， 并向培养瓶中加入CD3单克隆抗 体， 继续培 养2～3天后得到二代免疫细胞， 在显微镜下对二代免疫细胞计数； [0012]步骤六、 采用CIK细胞培养液将二代免疫细胞的密度调整至3 ×105～5×105/ml， 之 后置入培养瓶中扩大培养， 培养瓶中加入细胞裂解液， 培养2～3天， 即可得到三代免疫细 胞； [0013]步骤七、 从三代免疫细胞培 养物分离免疫细胞， 留下 无细胞培 养液待用； [0014]步骤八、 破碎三代免疫细胞， 离心后收集上清液C， 将上清夜C与无细胞培养液混说　明　书 1/3 页 3 CN 115501332 A 3