(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202211278491.7 (22)申请日 2022.10.19 (71)申请人 成都普乐密欣生物技 术有限公司 地址 610000 四川省成 都市高新区吉庆四 路188号1栋1单 元6层605号 (72)发明人 童吉宇　何容莹　 (74)专利代理 机构 重庆壹手知专利代理事务所 (普通合伙) 50267 专利代理师 张荣波 (51)Int.Cl. C12N 9/22(2006.01) G01N 33/573(2006.01) G01N 33/58(2006.01) A61K 45/00(2006.01) A61P 35/00(2006.01) (54)发明名称 一种高效检测核酸酶及抑制效果的方法 (57)摘要 本发明涉及核酸酶检测领域， 具体涉及一种 高效检测核酸酶及抑制效果的方法， 包括以下步 骤： S1： 搜索DO1核酸内切酶基因和蛋白质序列； S2： 表征DO1核酸内切酶蛋白质的亚细胞定位和 分布； S3： 定点诱导DNA断裂、 荧光定量PCR测定 HR， NHEJ和SSA修复的相对效率； S4： 表达与纯化 DO1核酸内切酶 ‑STREP蛋白； S5： 利用DO1核酸内 切酶基因功能抑制特异性攻击肿瘤细胞； S6： 采 用细胞计数或结晶紫染色方法测定细胞增殖能 力； S7： 测定细胞增殖能力； S8： 在利用DO1核 酸内 切酶抑制对肿瘤放射和化学治疗的致敏作用。 本 发明通过给治疗对象服用足够剂量的DO1核 酸内 切酶抑制性药物或SSA增强剂， 用于治疗或预防 带有TP53、 PTEN等抑癌基因突变、 基因表达或功 能缺陷的肿瘤。 权利要求书3页 说明书7页 CN 115466734 A 2022.12.13 CN 115466734 A 1.一种高效检测核酸酶抑制效果的方法， 其特 征在于， 包括以下步骤： S1： 搜索DO1核酸内切酶基因和蛋白质序列； S2： 表征DO1核酸内切酶蛋白质的亚细胞定位和分布； S3： 定点诱导DNA断裂、 荧 光定量PCR测定 HR， NHEJ和SSA修复的相对效率； S4： 表达与纯化DO1核酸内切酶 ‑STREP蛋白； S5： 利用DO1核酸内切酶基因功能抑制特异性 攻击肿瘤 细胞； S6： 采用细胞计数或结晶紫染色方法测定细胞增殖能力； S7： 测定细胞增殖能力； S8： 在利用DO1核酸内切酶抑制对肿瘤放 射和化学治疗的致敏作用。 2.根据权利要求1所述的一种高效检测核酸酶抑制效果的方法， 其特征在于， 所述搜索 DO1核酸内切酶基因和蛋白质序列包括以下步骤： S11： 通过NCBI数据库搜索DO1核酸内切酶基因和蛋白质 序列， 利用生物信息学软件绘 制DO1核酸内切酶基因在不同物种的进化 树和DO1核酸内切酶的蛋白质功能结构域； S12： 采用CRISPR/CAS9技术编辑DO1核酸内切酶基因， 获得DO1核酸内切酶基因敲除或 突变细胞株； S13： 采用siRNA技 术沉默DO1核酸内切酶基因， 以敲低DO1核酸内切酶基因表达； S14： 提取RPE ‑1细胞的蛋白质， 通过SDS ‑PAGE电泳分离蛋白质， 转移至聚偏二氟乙烯 膜； S15： 采用特异性的兔抗D O1核酸内切酶和羊抗兔HRP二抗检测 DO1核酸内切酶蛋白质水 平。 3.根据权利要求1所述的一种高效检测核酸酶抑制效果的方法， 其特征在于， 所述表征 DO1核酸内切酶蛋白质的亚细胞定位和分布包括以下步骤： S21： 采用免疫荧光、 染色质免疫共沉淀和核质分离的方法表征DO1核酸内切 酶蛋白质 的亚细胞定位和分布； S22： 在DiVA细胞 中开展ChIP实验， 由4 ‑OHT诱导A siSI‑ER核酸内切酶的表达， 在染色体 Chr1:89,458,595 ‑89,458,6 03处产生DNA断裂； S23： 4‑OHT诱导5小时后， 利用特异性 抗体沉淀相应蛋白质； S24： 通过PCR扩增 确定蛋白质在DNA断裂位 点处的富 集水平。 4.根据权利要求1所述的一种高效检测核酸酶抑制效果的方法， 其特征在于， 所述定点 诱导DNA断裂、 荧 光定量PCR测定 HR， NHEJ和SSA修复的相对效率包括以下步骤： S31： 采用I ‑Sce1核酸内切酶定点诱导DNA断裂， 荧光定量PCR测定HR， NHEJ和SSA修 复的 相对效率； S32： 采用可被多西环素诱导表达的野生型对D O1核酸内切酶缺陷细胞进行功能互补实 验； S33： 通过免疫荧光实验测定DO1核酸内切酶缺陷的细胞在DNA损伤后， 各种相关的DNA 修复因子在DNA损伤位 点的聚集能力。 5.根据权利要求1所述的一种高效检测核酸酶抑制效果的方法， 其特征在于， 所述表达 与纯化DO1核酸内切酶 ‑STREP蛋白包括以下步骤： S41： DO1核酸内切酶基因全长及其突变体通过PCR扩增后亚克 隆到pGEX4T1 ‑2strep载权　利　要　求　书 1/3 页 2 CN 115466734 A 2体上， 并转 化至BL21大肠杆菌 菌株中； S42： 将带有DO1核酸内切酶质粒的细菌在38℃的环境下培养至对数生长期， 加入1mM   IPTG诱导蛋白表达， 在17℃的环境下继续培 养16小时后离心收集细菌； S43： 将菌体重悬于NETN裂解液中， 利用超声破碎细胞后210 00x g离心， 收集上清液； S44： 在上清液中加入NETN裂解液预先洗涤过 的Strep‑Tactin XT磁珠， 5℃中孵育1.5 小时后弃去上清液； S45： 利用NETN裂解液洗涤磁珠6次， 加入S DS上样缓冲液提取 纯化蛋白； S46： 通过蛋白质免疫印迹检测纯化蛋白； 其中NETN裂解液由以下成分组成： 200mM NaCl； 40mM Tris‑Cl[pH 8.0]； 1mM EDTA0.6％N onidet P‑40。 6.根据权利要求1所述的一种高效检测核酸酶抑制效果的方法， 其特征在于， 所述利用 DO1核酸内切酶基因功能抑制特异性 攻击肿瘤 细胞包括以下步骤： S51： 在正常细胞中敲除DO1核酸内切 酶基因， 并将细胞连续传代， 测定其增殖曲线， 实 验周期为21 天； S52： 在肿瘤细胞中沉默DO1核酸内切 酶基因， 并将细胞连续沉默， 测定其增殖曲线， 实 验周期为21 天； S53： 计算存活细胞 数并存图记录； S54： 根据细胞计数结果计算增值率， 增值率＝(Nt ‑N0)/Nt*100％， 其中Nt是实验终点 细胞计数绝对值， N0是初始细胞接种数； S55： 将所有测定细胞系对照组与实验组实验终点增值 率进行双尾t ‑test检验。 7.根据权利要求1所述的一种高效检测核酸酶抑制效果的方法， 其特征在于， 所述采用 细胞计数或结晶紫染色方法测定细胞增殖能力包括以下步骤： S61： 在RPE ‑1和2F4细胞中将DO1核酸内切酶与其他功能基因共同沉默， 采用细胞计数 方法测定细胞增殖能力 S62： 在RPE ‑1和2F4细胞中将DO1核酸内切酶与酶抑制剂连用， 采用结晶紫染色方法测 定细胞增殖能力。 8.根据权利要求1所述的一种高效检测核酸酶抑制效果的方法， 其特征在于， 所述测定 细胞增殖能力包括以下步骤： S71： 在RPE ‑1或肿瘤细 胞中将DO1核酸内切酶与TP53功能基因共同沉默， 测定细 胞增殖 能力； S72： 将TP53表达质粒转入肿瘤细胞， 同时沉默D O1核酸内切酶基因表达， 通过细胞计数 的方法测定恢复功能的TP5 3基因对DO1核酸内切酶细胞毒性的拯救效应。 9.根据权利要求1所述的一种高效检测核酸酶抑制效果的方法， 其特征在于， 所述在利 用DO1核酸内切酶抑制对肿瘤放 射和化学治疗的致敏作用包括以下步骤： S81： 在24孔板中接种1万细胞， 24小时进行DO1核酸内切酶基因沉默实验， 实验周期设 定为21天； S82： 根据细胞生长 速率调整每次传代接种细胞 数；权　利　要　求　书 2/3 页 3 CN 115466734 A 3