(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202211033858.9 (22)申请日 2022.08.26 (66)本国优先权数据 202111146656.0 2021.09.2 9 CN (71)申请人 苏州艾凯利元生物科技有限公司 地址 215028 江苏省苏州市工业园区桑田 街218号生物医药产业园二期乐橙广 场5楼E495单 元 (72)发明人 贺智勇　刘晓东　陈家斌　 (74)专利代理 机构 苏州锦尚知识产权代理事务 所(普通合伙) 32502 专利代理师 滕锦林　翁亚娜 (51)Int.Cl. C12N 5/0783(2010.01) A61K 35/17(2015.01)A61P 31/00(2006.01) A61P 35/00(2006.01) A61P 37/00(2006.01) (54)发明名称 产生自然杀伤细胞的方法 (57)摘要 本发明涉及产生自然杀伤(NK)细胞的方法， 该方法包括培养多能干细胞(PSC)以产生胚状 体， 在包含NK分化因子的分化培养基中分化胚状 体以促进分化为NK细胞； 在包含IL ‑2的扩增培养 基中扩增细胞以产生NK细胞。 本发明还 涉及通过 该方法产生的NK细胞、 包含通过该方法产生的NK 细胞的药物组合物以及该NK细胞或NK细胞群在 治疗疾病中的方法和用途。 权利要求书2页 说明书15页 附图6页 CN 115261318 A 2022.11.01 CN 115261318 A 1.产生自然杀伤(NK)细胞的方法， 所述方法包括： a)培养多能干细胞(P SC)以生成胚 状体； b)在包含NK分化因子的分化培 养基中分化所述胚 状体以促进分化 为所述NK细胞； 和 c)在包含IL‑2的扩增培 养基中扩增b)的细胞以产生所述 NK细胞。 2.根据权利要求1所述的方法， 其中所述 NK分化因子是白介素2(I L‑2)； 优选地， 所述分化培养基进一步包含以下中的一种或多种： Fms样酪氨酸激酶3配体 (FT3L)、 白介素3(I L‑3)、 白介素15(I L‑15)。 3.根据权利要求2所述的方法， 其中所述分化培 养基包含浓度为1‑150U/mL的I L‑2； 优选地， 所述分化培 养基包含浓度为1‑15ng/mL的I L‑3； 优选地， 所述分化培 养基包含浓度为1‑30ng/mL的FT3L； 优选地， 所述分化培 养基包含浓度为1‑30ng/mL的I L‑15。 4.根据权利 要求1所述的方法， 其中所述PSC是人类胚胎干细 胞(hESC)或诱导多能干细 胞(iPSC)； 优选地， 所述分化培 养基包含人血清。 5.根据权利 要求1所述的方法， 其 中所述NK细胞表达以下中的一种或多种： CD45、 CD56、 CD16、 杀伤免疫球蛋白样受体(KIR)、 NKG2D、 NKp44、 NKp46、 Fas配体(FasL)和肿瘤坏死因子 (TNF)相关的凋亡诱 导配体(TRAIL)； 优选地， 相对于参照NK细胞， 所述NK细胞表现出以下中的一种或多种的表达增加： CD45、 CD56、 CD16、 KIR、 NKG2D、 NKp44、 NKp46、 FasL和TRAIL， 所述参照NK细胞根据除了 下述的 权利要求 1所述的方法分化： 在b)中所述分化培养基包含 所述NK分化因子和/或在c)中所述 扩增培养基包含IL‑2。 6.根据权利要求1所述的方法， 其中c)扩增包括共培 养所述NK细胞与饲养细胞系； 优选地， 所述饲养细胞系是 K562髓系白血病细胞系； 优选地， 其中K5 62细胞系表达膜结合 IL‑21； 优选地， 所述共培 养以5:1至1:5的NK细胞与饲养细胞系的比率进行。 7.根据权利要求1的方法， 包括b)培 养约5‑20天； 优选地， 包括在b)之后且c)之前， 在不包含所述NK分化因子的培养基中培养所述胚状 体； 优选地， 包括在b)之后且c)之前， 在不包含所述NK分化因子的培养基中将所述胚状体 培养约5‑10天； 优选地， 所述方法包括c)扩增约10 ‑50天。 8.自然杀伤(NK)细胞， 其 根据权利要求1所述的方法产生； 优选地， 所述的NK细胞， 其表达以下中的一种或多种： CD45、 CD56、 CD16、 杀伤免疫球蛋 白样受体(KIRs)、 NKG2D、 NKp44、 NKp46、 Fas配体(FasL)和肿瘤坏死因子(T NF)相关的凋亡诱 导配体(TRAIL)； 优选地， 相对于参照NK细胞， 所述NK细胞表现出以下中的一种或多种的表达增加： CD45、 CD56、 CD16、 KIR、 NKG2D、 NKp44、 NKp46、 FasL和TRAIL， 所述参照NK细胞根据除了 下述的 权利要求1所述的方法分化： 在b)中所述分化培 养基包含所述NK分化因子 。 9.药物组合物， 其包 含权利要求8所述的NK细胞；权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 115261318 A 2优选地， 所述的药物组合物， 其包 含另外的治疗剂； 优选地， 所述的药物组合物， 其中所述另外的治疗剂是抗体。 10.免疫治疗方法， 其包括向个体施用根据权利要求8所述的NK细胞或根据权利要求9 所述的药物组合物。 11.根据权利要求8所述的NK细胞在制造用于个 体的免疫 治疗的药物中的用途。 12.根据权利要求10所述的方法或根据权利要求11所述的用途， 其中所述个体患有癌 症或传染病； 优选地， 所述传染病选自由下列组成的组： 人类免疫缺陷病毒(HIV)、 爱泼斯坦 ‑巴尔病 毒(EBV)、 单纯疱疹病毒(HSV)、 巨细胞病毒(CMV)、 水痘 ‑带状疱疹病毒(VZV)、 乙型肝炎病毒 (HBV)和丙型肝炎病毒(H CV)。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 115261318 A 3