(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202211177932.4 (22)申请日 2022.09.22 (71)申请人 沈阳药科大学 地址 117004 辽宁省本溪市高新 技术产业 开发区华佗大街26号 (72)发明人 孙进　卢雨彤　王开元　赵健　 何仲贵　 (74)专利代理 机构 沈阳东大知识产权代理有限 公司 21109 专利代理师 马海芳 (51)Int.Cl. C12N 5/0784(2010.01) A61K 9/51(2006.01) A61K 47/46(2006.01) A61K 39/00(2006.01)A61K 39/39(2006.01) A61K 39/395(2006.01) A61K 47/42(2017.01) A61P 35/00(2006.01) A61P 35/04(2006.01) A61P 37/04(2006.01) (54)发明名称 修饰化外泌体及其制法和外泌体联合PD-1 抗体的原位喷雾水凝胶和应用 (57)摘要 一种修饰化外泌体及其制法和外泌体联合 PD‑1抗体的原位喷雾 水凝胶和应用， 属于医药技 术领域， 将CpG寡聚脱氧核苷酸和肿瘤特异性蛋 白OVA共载于外泌体上， 得到修饰化外泌体。 并通 过联合PD ‑1抗体(aPD ‑1)和上述修饰化外泌体装 载于原位喷雾 水凝胶基质中制得外泌体联合PD ‑ 1抗体的原位喷雾水凝胶。 该外泌体联合PD ‑1抗 体的原位喷雾 水凝胶能释放CpG可刺激肿瘤浸润 处的树突状细胞成熟， 从而激活肿瘤浸润的T细 胞， 同时该外泌体联合PD ‑1抗体的原位喷雾水凝 胶能够归巢至肿瘤引流淋巴结中， 刺激淋巴结中 的树突状细胞成熟， 增加了T细胞的浸润。 并且能 够延长了小鼠的存活期， 降低了黑色素瘤术后的 复发率。 权利要求书2页 说明书8页 附图8页 CN 115537399 A 2022.12.30 CN 115537399 A 1.一种修饰化外泌体， 其特征在于， 该修饰化外泌体为同时载有CpG寡聚脱氧核苷酸和 肿瘤特异性蛋白OV A的外泌体。 2.根据权利要求1所述的修饰化外泌体， 其特征在于， 所述的外泌体为树突状细胞衍生 的外泌体。 3.根据权利要求1所述的修饰化外泌体， 其特征在于， 按比例， 产生树突状细胞衍生的 外泌体的树 突状细胞的个数： 肿瘤特异性蛋白OV A为： 1×106个： 200‑400 μg； 按质量百分比， CpG寡聚脱氧核苷酸 为3％‑5％， 余量为肿瘤特异性蛋白OV A和外泌体。 4.权利要求1 ‑3任意一项所述的修饰化外泌体的制备方法， 其特征在于， 包括以下步 骤： S1： 收集培养小鼠骨髓来源的并给予OVA刺激的树突状细胞的无血清培养液， 通过外泌 体提取分离试剂盒除去细胞及 细胞碎片， 使用PBS重悬后， 得到空白的外泌体； S2： 将CpG ODN与硫醇还原剂混合并充分搅拌， 得到混合溶 液； S3： 将胺‑巯基交联剂添加到混合溶液中继续搅拌， 去除过量的硫醇还原剂和胺 ‑巯基 交联剂后， 在室温下与空白的外泌体在PBS溶 液中孵育， 得到修饰化外泌体。 5.根据权利要求4所述的修饰化外泌体的制备方法， 其特征在于， 所述的树突状细胞为 鼠源性， 从C57BL/6小鼠的股骨和胫骨提取而来； 所述的给予OVA刺激的树突状细胞的无血 清培养液的制备过程为： 在含有 1×106个树突状细胞培养基中， 以培养基的体积为基准， 添 加20ng/mL鼠粒细胞 ‑巨噬细胞集落刺激因子， 添加5ng/mL白细胞介素 ‑4以及50 μM/L  β‑巯 基乙醇； 在37℃加湿培养箱中培养3天后， 用补 充有相同体积的GM ‑CSF和IL‑4的新鲜培养基 替换； 在第6天收集树突状细胞， 在含有300 μg/mL的OVA的新鲜培养基中孵育过夜； 然后加入 30ng/mL LPS刺激树突状细胞成熟； 随后， 使用无血清的培养基培养表达OVA的树突状细胞， 收集其培养液。 6.根据权利要求4所述的修饰化外泌体的制备方法， 其特征在于， 所述的硫醇还原剂为 三(2‑羧乙基)膦和/或二硫苏糖醇； 按摩尔比， CpG  ODN： 硫醇还原剂＝1： 5 000； 所述的胺 ‑巯基交联剂为4 ‑(N‑马来酰亚胺甲基)环己烷 ‑1‑羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯 钠盐； 按摩尔比， CpG  ODN： 胺‑巯基交联剂为1： 1.5 。 7.一种外泌体联合PD ‑1抗体的原位喷雾水凝胶， 其特征在于， 包括原位喷雾水凝胶基 质、 PD‑1抗体和权利要求1 ‑3任意一项 所述的修饰化外泌体， 外泌体联合PD ‑1抗体的原 位喷 雾水凝胶通过 联合PD‑1抗体和修饰化外泌体装载于原位喷雾水凝胶基质中制得。 8.根据权利要求7所述的外泌体联合PD ‑1抗体的原位喷雾水凝胶， 其特征在于， 所述的 原位喷雾水凝胶基质由纤维蛋白原和 凝血酶组成， 当等体积的纤维蛋白原溶液(10mg/mL) 与凝血酶溶液(100U/mL)接触时， 该基质发生凝胶化， 得到原位喷雾水凝胶基质； 通过喷雾 混合等体积的含有修饰化外泌体的凝血酶溶液和含有PD ‑1抗体的纤维 蛋白原溶液， 形成外 泌体联合P D‑1抗体的原位喷雾水凝胶。 9.根据权利要求7所述的外泌体联合PD ‑1抗体的原位喷雾水凝胶， 其特征在于， 按固液 比， PD‑1抗体： 修饰化外泌体中所含CpG  ODN： 原位喷雾水凝胶基质＝6 ‑8 μg： 30‑50 μg： 100 ‑ 300 μL； 其中， aPD ‑1均匀分散在原位喷雾水凝胶基质的纤维蛋白原溶液中， 修饰化外泌体均 匀分散在原位喷雾水凝胶基质的凝血酶溶 液中。 10.权利要求7 ‑9任意一项所述的外泌体联合PD ‑1抗体的原位喷雾水凝胶的应用， 用于权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 115537399 A 2作为抑制和/或治疗黑色素瘤术后复发药剂的应用。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 115537399 A 3