(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210912645.7 (22)申请日 2022.07.30 (71)申请人 哈尔滨商业大学 地址 150000 黑龙江省哈尔滨市道里区通 达街138号 (72)发明人 凌娜　汲晨锋　徐贵国　高铭泽　 (74)专利代理 机构 深圳汇策知识产权代理事务 所(普通合伙) 44487 专利代理师 迟芳 (51)Int.Cl. C08B 37/00(2006.01) A61P 35/00(2006.01) (54)发明名称 具有抗肿瘤功效的沙棘均一多糖及其分离 纯化方法及应用 (57)摘要 具有抗肿瘤功效的沙棘均一多糖及其分离 纯化方法及应用， 它涉及多糖及其分离纯化方法 和应用， 它是要解决现有沙棘多糖提取方法存在 成分易被破坏、 耗时长、 过程繁琐、 提取率低的技 术问题。 本发明的沙棘均一多糖为HSP ‑0、 HSP‑1、 HSP‑2或HRP‑3； 它们由阿拉伯糖、 葡萄糖、 甘露 糖、 木糖、 葡萄糖醛酸、 半乳糖、 鼠李 糖构成。 它们 是先利用闪式提取， 再脱蛋白、 脱色后用DEA E‑52 纤维柱梯度洗脱， 再用Sepha dex G‑200色谱柱分 离纯化后得到的。 它们对人胃癌SGC ‑7901和肺腺 癌A549细胞具有显著的抑制作用， 特别是沙棘酸 性多糖HRP ‑3的活性和得率最高， 可用于人胃癌 和肺腺癌的治 疗领域。 权利要求书2页 说明书8页 附图5页 CN 115028753 A 2022.09.09 CN 115028753 A 1.具有抗肿瘤功效 的沙棘均 一多糖， 其特征在于为沙棘均 一多糖为HSP ‑0、 HSP‑1、 HSP‑ 2或HRP‑3； 其中HSP‑0是由阿拉伯糖、 半乳糖、 葡萄糖、 甘露糖、 木糖与鼠李糖按摩尔比为12.25： 3.77： 2.89： 1.45： 1： 0.34构成的多糖； HSP‑1是由葡萄糖、 甘露糖、 阿拉伯糖、 木糖与半乳糖按摩尔比为28.77： 3.23： 1.25： 1： 1.62构成的多糖； HSP‑2是由葡萄糖、 甘露糖、 木糖、 半乳糖与鼠李糖按摩尔比为2.55： 0.45： 1： 0.77： 0.32 构成的多糖； HRP‑3是由阿拉伯糖、 葡萄糖、 甘露糖、 木糖、 葡萄糖醛酸与半乳糖按摩尔比为1.05： 3.56： 2.47： 1： 1.87： 0.74构成的多糖。 2.根据权利要求1所述的具有抗肿瘤功效的沙棘均一多糖， 其特征在于沙棘均一多糖 HRP‑3的分子结构式为： ， 其中 n=10~20。 3.权利要求1所述的具有抗肿瘤功效的沙棘均一多糖的分离纯化方法， 其特征在于该 方法按以下步骤进行： 一、 将沙棘干果去除表面杂质， 粉碎、 过筛， 获得沙棘粗粉； 石油醚回流提取， 此过程需 重复2次， 每次 时间为1h~1.5h； 除去沙棘 果中含有的脂溶性物质， 抽滤， 得到 沙棘果渣； 二、 按1mg沙棘果渣中加入20~40mL蒸馏水的比例， 将沙棘果渣与蒸馏水混合， 然后施加 电压进行闪式提取， 控制电压为120~190V， 提取时间80~130s， 提取温度70~90℃， 得到提取 液； 三、 将提取液过滤、 浓缩； 然后再向浓缩液中加入无水乙醇， 无水乙醇与浓缩液的体积 比为4∶ 1， 在温度为 4℃条件下醇沉、 离心、 浓 缩、 干燥， 获得沙棘 粗多糖； 四、 采用Seva g法对沙棘 粗多糖进行脱蛋白处 理， 获得脱蛋白的沙棘多糖； 五、 溶解脱蛋白的沙棘多糖， 调pH值至8.0， 加入H2O2溶液， 脱色1.5～2h， 获得脱色的沙 棘多糖； 六、 将脱色后的沙棘多糖置于透析袋中流水透析24h～48h， 再用蒸馏水透析24h～48h； 最后加入质量百分浓度为95%的乙醇， 室温醇沉， 离心、 浓 缩、 真空干燥， 得到 沙棘精多糖； 七、 配制5mg/mL沙棘精多糖溶液， 离心、 0.45 μm滤膜过滤， 然后加入到预平衡好的DEAE ‑ 52纤维柱中， 分别采用浓度为0、 0.1、 0.3、 0.5mol/L的NaCl溶液进行梯度洗脱， 控制流速为 0.8mL/min， 每管2mL； 采用苯酚 ‑硫酸法在490nm处对洗脱液进行跟踪检测， 绘制洗脱曲线， 分别收集洗脱峰液体； 再用蒸馏水透析24h~48h， 冷冻干燥， 获得四种沙棘多糖组分； 八、 将每一种沙棘多糖组分溶解于蒸馏水中配制5mg/mL， 离心、 过滤， 然后加入到预平 衡好的Sephadex  G‑200色谱柱中， 采用0.005  mol/L、 pH值为  6.2的磷酸盐缓冲液进行洗 脱， 从而使大小不同的多糖 分子得到分离纯化， 控制流速为0.8mL/min， 每管2mL； 采用苯酚 ‑ 硫酸法在490nm处对层析液进行跟踪检测， 分别收集单一洗脱峰液体， 再用蒸馏水透析24h权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 115028753 A 2～48h， 冷冻干燥， 获得沙棘均一多糖HS P‑0、 HSP‑1、 HSP‑2和HRP‑3。 4.根据权利要求3所述的具有抗肿瘤功效的沙棘均一多糖的分离纯化方法， 其特征在 于步骤二中所述的闪式提取， 按1mg沙棘果渣中加入30mL蒸馏水的比例将沙棘果渣与蒸馏 水混合， 提取电压为180V， 提取时间为120s， 提取温度为75℃。 5.根据权利要求3或4所述的具有抗肿瘤功效的沙棘均一多糖的分离纯化方法， 其特征 在于步骤三中所述的醇沉的时间为10 h~12h。 6.根据权利要求3或4所述的具有抗肿瘤功效的沙棘均一多糖的分离纯化方法， 其特征 在于， 步骤四中所述的Sevag法脱蛋白处理的具体操作为： 将沙棘粗多糖配制成饱和水溶 液， 然后向沙棘粗多糖水溶液中加入Sevag试剂并振荡10min~20min， 然后 在转速为5000rpm 的条件下离心10min， 弃去固相物， 重复2~3次， 取上清液浓缩干燥， 得脱蛋白的沙棘多糖； 其 中所述的  Sevag试剂是用C HCl3与CH3(CH2)3OH按体积比为 （3~5） ： 1混合而成的。 7.根据权利要求3或4所述的具有抗肿瘤功效的沙棘均一多糖的分离纯化方法， 其特征 在于， 步骤五中所述的H2O2溶液的质量百分浓度为6%~7%， 脱色温度为 48℃～50℃。 8.根据权利要求3或4所述的具有抗肿瘤功效的沙棘均一多糖的分离纯化方法， 其特征 在于， 步骤六中所述的醇沉， 是加入3~5倍体积的95%乙醇， 在室温下， 醇沉20 h～24h。 9.根据权利要求3或4所述的具有抗肿瘤功效的沙棘均一多糖的分离纯化方法， 其特征 在于， 步骤七中， 用浓度为0的NaCl溶液， 即蒸馏水洗脱时， 洗脱峰液体主要成分为HRP ‑0； 用 浓度为0.1  mol/L的NaCl溶液洗脱时， 洗脱峰液体中主要成分为HRP ‑1； 用浓度为0.3  mol/L 的NaCl溶液洗脱时， 洗脱峰液体中主要成分为HRP ‑2； 用浓度为0.5  mol/L的NaCl溶液洗脱 时， 洗脱峰液体中主 要成分为HRP ‑3。 10.权利要求1所述的具有抗肿瘤功效的沙棘均一多糖的应用， 其特征在于该应用是将 具有抗肿瘤功效的沙棘均一多糖作为治疗胃癌和肺腺癌的药物的应用。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 115028753 A 3