ICS65.020.30 CCSB43 中华人民共和国国家标准 GB/T45202—2025 牛体外胚胎生产和移植技术规程 Codeofpracticeforinvitroembryoproductionandtransferincattle 2025-01-24发布 2025-08-01实施 国家市场监督管理总局 国家标准化管理委员会发布前 言 本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则 第1部分:标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由中华人民共和国农业农村部提出。 本文件由全国畜牧业标准化技术委员会(SAC/TC274)归口。 本文件起草单位:西北农林科技大学、内蒙古大学、天津力牧生物科技有限公司、内蒙古赛科星繁育 生物技术(集团)股份有限公司。 本文件主要起草人:张涌、刘军、张景程、李光鹏、王勇胜、李喜和、孙伟、张立、郝少强、王娜。 ⅠGB/T45202—2025 牛体外胚胎生产和移植技术规程 1 范围 本文件确立了牛体外胚胎生产和移植过程中的操作流程,规定了体外胚胎生产的基本要求、供体的 选择与处理、卵母细胞采集、体外成熟、体外受精、体外培养、胚胎冷冻与解冻、胚胎移植与妊娠检查技术 要求,描述了证实方法。 本文件适用于牛体外胚胎生产和移植。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文 件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于 本文件。 GB/T6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T25881 牛胚胎 GB/T26938 牛体内胚胎生产与移植技术规程 3 术语、定义和缩略语 3.1 术语和定义 GB/T25881和GB/T26938界定的以及下列术语和定义适用于本文件。 3.1.1 卵丘-卵母细胞复合体 cumulus-oocytecomplexes;COCs 卵丘细胞包裹卵母细胞形成的复合体。 3.1.2 体外成熟 invitromaturation;IVM COCs在体外适宜条件下培养,使卵母细胞发育成熟,排出第一极体并具有受精能力的过程。 3.1.3 精子纯化 spermpurification 从精液中分离获得活精子的操作过程。 3.1.4 体外受精 invitrofertilization;IVF 精子和成熟卵母细胞在体外环境下完成受精的过程。 3.1.5 体外培养 invitroculture;IVC 受精卵在体外适宜环境下培养的过程。 3.2 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 1GB/T45202—2025 BLR:囊胚率(blastocystrate) CLR:卵裂率(cleavagerate) CR:产犊率(calvingrate) FSH:促卵泡素(follicle-stimulatinghormone) OPU:活体采卵(ovumpick-up) PR:妊娠率(pregnancyrate) 4 技术流程 见图1。 图1 牛体外胚胎生产和移植技术流程图 2GB/T45202—2025 5 基本要求 5.1 设施设备 宜配备: a) 设施:百万级以上洁净实验室; b) 仪器设备:活体采卵仪、体视显微镜、离心机、精子密度测定仪、CO2培养箱、三气培养箱、恒温 台、水浴锅。 5.2 培养条件 卵母细胞体外成熟和体外受精应在38.5℃、5%(体积分数)CO2空气和饱和湿度下培养;体外胚胎 应在38.5℃、5%(体积分数)CO2、7%(体积分数)O2、88%(体积分数)N2和饱和湿度下培养。 5.3 试剂 5.3.1 化学试剂纯度应达到细胞或胚胎培养级别的要求。 5.3.2 试验用水应符合GB/T6682二级水的要求,电阻率达到18.2MΩ·cm(25℃)。 6 供体的选择与处理 6.1 供体的选择 供体应满足以下条件。 a) 符合本品种标准,遗传性能稳定,种用价值高,三代系谱清楚。 b) 生殖器官和卵巢机能正常。 c) OPU青年牛宜为10月龄以上,经产牛宜产后40d以上;体况适中,评分宜2.75以上(5分制)。 d) 无遗传缺陷病和传染病。 6.2 供体的处理 6.2.1 非超排处理 利用活体采卵仪直接采卵,宜间隔3d~4d采集一次。 6.2.2 超排处理 供体超排处理程序如下: a) 第0天用活体采卵仪检查卵巢,宜刺破直径(ϕ)>5mm的卵泡; b) 第2天和第3天间隔12h各注射一次FSH,可根据FSH制剂活性、供体品种和体况确定 FSH适宜剂量; c) 第5天进行OPU; d) 重复超排处理间隔宜大于14d。 7 卵母细胞采集 7.1 供体屠宰后卵巢卵母细胞的采集 供体屠宰后的新鲜卵巢置于20℃~25℃含有抗生素的生理盐水中,6h内运输到实验室。用 3GB/T45202—2025 30℃~37℃预热的生理盐水清洗3次~4次。一次性注射器或真空负压泵连接21G针头,针口向下 刺入ϕ2mm~8mm的卵泡,吸取卵泡液和COCs,移到细胞培养皿中,置于38.5℃恒温台上,体视显微 镜下收集COCs,转移到预热38.5℃的采卵液(见附录A中A.1)中。 7.2 活体采卵 7.2.1 采卵前准备 保定供体,清除直肠宿粪,硬膜外麻醉,清洗、消毒会阴部及外阴;50mL离心管与负压泵和采卵针 连接,置于恒温槽上;吸取少量采卵液润洗采卵管。 7.2.2 采卵过程 供体采卵过程如下: a) 操作人员一只手将活体采卵仪超声波探头插入供体阴道至穹隆处,另一只手通过直肠把握将 一侧卵巢隔着阴道穹隆壁紧贴超声波探头; b) 调整超声波探头与卵巢的相对位置,使卵泡位于进针线上,开启真空泵并推进采卵针穿刺卵 泡,采集卵泡液和COCs; c) 采集所有ϕ2mm~8mm卵泡后,冲洗采卵针及采卵管,使COCs进入离心管; d) 采用同样的方法对另一侧卵巢进行COCs采集; e) 如有血液阻塞采卵针或采卵管,应将采卵针撤出并提高负压,吸取采卵液以疏通采卵针和采 卵管; f) 将采集的卵泡液和COCs转移到集卵杯过滤液体,置于38.5℃恒温台上,体视显微镜下收集 COCs,转移到预热38.5℃的采卵液中。 8 体外成熟 8.1 成熟液微滴的准备 在细胞培养皿中制作100μL的成熟培养液(见A.2)微滴,用矿物油覆盖,CO2培养箱中平衡2h 以上。 8.2 COCs的分级 体视显微镜下按形态学方法将COCs分为如下4个级别。 a) A级:卵母细胞胞质均匀,包裹5层以上完整而致密的卵丘细胞。A级卵母细胞图见附录B中 图B.1a)。 b) B级:卵母细胞胞质均匀,包裹3层~5层的卵丘细胞。B级卵母细胞图见图B.1b)。 c) C级:卵母细胞胞质均匀或不均匀,包裹1层~3层卵丘细胞。C级卵母细胞图见图B.1c)。 d) D级:卵丘细胞已经松散或几乎是裸卵。D级卵母细胞图见图B.1d)。 8.3 COCs的培养 挑选A级、B级和C级COCs,采卵液中清洗3次,用平衡的成熟培养液清洗3次,移入成熟培养液 微滴中,每头供体的COCs应单独培养,每个微滴宜10个~20个COCs,置于CO2培养箱中培养。 9 体外受精 9.1 受精液微滴的准备 在细胞培养皿中制作90μL体外受精液(见A.3)微滴,用矿物油覆盖,CO2培养箱中平衡2h以上。 4GB/T45202—2025