(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210794397.0 (22)申请日 2022.07.05 (71)申请人 华中农业大 学 地址 430070 湖北省武汉市洪山区狮子山 街1号 (72)发明人 晏向华　何子怡　吴浩　康勤书　 丁驰竹　谢春琳　夏梦琳　滕峻永　 李雅喆　李茜薇　沈秋霞　 (74)专利代理 机构 武汉开元知识产权代理有限 公司 42104 专利代理师 冯超 (51)Int.Cl. C12M 3/04(2006.01) C12M 1/42(2006.01) C12M 1/26(2006.01)C12M 1/21(2006.01) C12M 1/00(2006.01) C12N 5/071(2010.01) B01L 3/00(2006.01) (54)发明名称 双层猪肠道芯片和猪人工肠道系统及其制 作和应用 (57)摘要 本发明公开了一种双层猪肠道芯片和猪人 工肠道系统及其制作和应用； 它包括上层芯片、 中间的多孔膜和下层芯片， 所述上层芯片和下层 芯片上均布置有弯曲肠型通道和侧向电极通道； 该猪人工肠道系统由双层猪肠道芯片、 除泡器、 流体灌注装置及连接管路 组成。 提取仔猪肠道隐 窝三维培养获得猪肠道类器官， 随后将其培养于 双层芯片多孔膜上。 通过培养基持续灌注， 获得 包含猪肠道上皮所有终末分化细胞类型、 具有三 维肠道结构和上皮屏障功能的猪人工肠道系统。 本发明解决了猪肠道研究缺乏生理相关性高、 可 操作性强的体外模型的问题， 可为动物营养与肠 道健康相关研究提供基于器官水平的创新研究 体系。 权利要求书2页 说明书9页 附图6页 CN 114989982 A 2022.09.02 CN 114989982 A 1.一种双层猪肠道芯片， 其特征在于： 它包括上层芯片(1.1)、 中间 的多孔膜(1.2)和下 层芯片(1.3)； 所述上层芯片(1.1)上布置有上层通道(1.1.1)， 所述上层通道(1.1.1)两端 的上层芯片(1.1)上分别开设有上层通道进样口(1.1.3)和上层通道出样口(1.1.4)， 所述下层芯片(1.3)上布置有下层通道(1.3.1)， 所述上层通道(1.1.1)和下层通道 (1.3.1)的中间主体部分对称重 叠设置； 所述上层芯片(1.1)上还开设两个通孔， 两个通孔与下层通道(1.3.1)两端上下对应设 置， 分别下层通道进样口(1.1.5)和下层通道出样口(1.1.6)； 且多孔膜(1.2)也对应开孔， 分别与下层通道进样口(1.1.5)和下层通道出样口(1.1.6)形成一体通道。 2.根据权利要求1所述双层猪肠道芯片， 其特征在于： 所述上层通道(1.1.1)和下层通 道(1.3.1)为弯 曲型， 所述上层通道(1.1.1)和下层通道(1.3.1)的重叠区域呈弯 曲的“肠 型”且它们的两端部分均分叉设置 。 3.根据权利要求1所述双层猪肠道芯片， 其特征在于： 所述上层通道(1.1.1)的重叠区 域弯曲处外侧对称开设有两个上层电极通道(1.1.2)， 所述上层电极通道(1.1.2)内设置有 上层铂丝电极(1.1.7)， 所述上层铂丝电极(1.1.7)一端插入上层通道(1.1.1)侧壁内， 另一 端伸出上层芯片(1.1)外， 两个上层铂丝电极(1.1.7)组成上层铂丝电极组； 所述下层通道(1.3.1)的重叠区域弯曲处外侧对称开设有两个下层电极通道(1.3.2)， 所述下层电极通道(1.3.2)内设置有下层铂 丝电极(1.3.3)， 所述下层铂 丝电极(1.3.3)一 端插入下层通道(1.3.1)侧壁上， 另一端伸出上层芯片(1.1)外， 两个下层铂丝电极(1.3.3) 组成下层铂丝电极组； 且上层铂丝电极组和下层铂丝电极组上 下交错布置 。 4.根据权利要求3所述双层猪肠道芯片， 其特征在于： 所述上层通道(1.1.1)和下层通 道(1.3.1)的高度均为100～1000 μm， 宽度均为100～200 μm， 长度均为5～100mm； 所述多 孔膜 (1.2)的孔径为0.4～10 μm； 所述上层铂丝电极(1.1.7)和下层铂丝电极(1.3.3)直径均为(200)μm， 长度均为6～ 10mm。 5.一种双 层猪肠道芯片的制作方法， 其特 征在于： 包括以下步骤： 1)设计上层通道和下层通道的形状结构， 利用光刻法制作上层通道和下层通道的模 具， 浇筑聚二甲基硅氧烷预聚物和固化剂的混合物， 固化、 脱模、 切割， 得到上层芯片和下层 芯片， 且上层芯片和下层芯片上形成上层通道和下层通道； 上层芯片分别开设有上层通道 进样口、 上层通道出样口、 下层通道进样口和下层通道出样口； 2)裁剪多孔膜， 备用； 3)将上层 芯片和下层芯片的粘贴面沾取有聚二甲基硅氧烷胶； 然后将剪裁好的多孔膜 贴于上层芯片， 再将下层芯片贴于多孔膜上， 使上层芯片、 多孔膜和下层芯片粘合在一起， 室温干燥； 最后使用针头对应下层通道进样口和下层通道出样口将多孔膜打通； 4)将4根铂丝电极分别经上层电极通道和下层电极通道内插入上层通道和下层通道内 100 μm， 在上层电极通道和下层电极通道入口处滴加紫外固化胶， 将芯片用紫外灯曝光10s 使胶固化， 密封侧通道， 制成双 层猪肠道芯片， 备用。 6.一种权利要求1所述的双层猪肠道芯片的应用， 其特征在于： 所述应用为在芯片内培 养猪肠道上皮细胞系或肠道类器官， 体外模拟 猪肠道的细胞 组成、 三维结构、 流体微环境和 屏障功能， 其中， 所述双层猪肠道芯片用于培养肠道类器官或猪肠道上皮细胞系时， 将肠道权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114989982 A 2类器官或猪肠道上皮细胞系注入双 层猪肠道芯片的上层通道内培 养。 7.一种猪人工肠道系统， 其特征在于， 包括流体灌注装置(2)， 所述流体灌注装置(2)通 过连接管路(3)与猪肠道芯片组件， 所述猪肠道芯片组件包括权利要求(1)所述的双层猪肠 道芯片(1)， 所述双层猪肠道芯片(1)的上层通道进样口(1.1.3)和下层通道进样口(1.1.5) 分别与两个独立的除泡器(4)连接， 所述上层通道出样口(1.1.4)和下层通道出样口 (1.1.6)分别与两个离心管(5)单独连接 。 8.根据权利要求7所述猪人工肠道系 统， 其特征在于， 所述除泡器(4)是将PDMS预聚物 与固化剂混合后倒入模具中固化， 随后切割、 打孔， 并与载玻片键合而成， 其内部形成除泡 通道， 所述除泡通道包括水平的连接通道(4.1)， 所述连接通道两端设置两个孔道， 分别为 连接通道的进样口(4.2)和出样口(4.3)； 所述进样口(4.2)和出样口(4.3)分别与流体灌注 装置(4)流体灌注装置(2)和双层猪肠道芯片(1)连通； 所述连接通道(4.1)间设置有1个除 泡腔室(4.4)或间隔设置有多个除泡腔室(4.4)； 其中， 所述除泡腔室(4.4)呈直角梯形体， 所述连接通道(4.1)的高度为0.2～5mm， 所述除泡腔室(4.4)的高度为8～30mm， 且所述除泡 腔室(4.4)斜 面的角度为3 0～75°。 9.一种权利要求7所述的猪人工肠道系统 的应用； 其特征在于： 所述应用为培养猪肠道 上皮细胞系或肠道类器官， 体外模拟猪肠道的细胞组成、 三维结构、 流体微环境和屏障功 能、 肠道微生物 ‑宿主互作、 肠道损伤与修复、 饲料营养价值评估、 药物筛选与效果评价、 饲 料安全等检测及其相关研究。 10.一种权利要求7 所述的猪人工肠道系统的使用方法， 其特 征在于： 包括以下步骤： 1)将Ⅰ型鼠尾胶原与基质胶的混合溶液注入芯片上下层通道内， 37℃孵育1h； 孵育结束 后， 使用DMEM ‑F12培养基清洗通道， 备用； 其中， 所述 Ⅰ型鼠尾胶原浓度为100 μg/mL， 基质胶 的浓度为2％； 2)将猪肠道上皮细胞悬液或肠道类器官悬液注入上层 芯片的上层通道内， 在培养箱内 静置培养2～24h， 使其贴壁生长于多孔膜上； 然后将双层猪肠道芯片与除泡器和 离心管连 接； 3)将完全培养基经脱气处理后预热至37℃， 然后利用流体灌注装置将培养基经除泡器 除泡后进入双层猪肠道芯片进 行上皮细胞或类器官的流动培养， 废弃的培养基流入至离心 管中， 流动培 养的流速为3 0～60 μL/h， 培养时间为5～14天。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114989982 A 3