(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202211023571.8 (22)申请日 2022.08.25 (71)申请人 郑州大学 地址 450000 河南省郑州市高新区科 学大 道100号 (72)发明人 陈胜　吕梦雅　范嘉怡　张文婷　 张书胜　 (74)专利代理 机构 郑州异开专利事务所(普通 合伙) 41114 专利代理师 杜雪丽 (51)Int.Cl. G01N 21/01(2006.01) G01N 21/65(2006.01) (54)发明名称 一种内标辅助花瓣状SERS纳米探针及其制 备方法、 应用 (57)摘要 本发明公开了一种内标辅助花瓣状SERS纳 米探针及其制备方法、 应用， 其中， 本发明的内标 辅助花瓣状SERS纳米探针是由金纳米球内核、 内 标修饰分子、 花瓣状金纳米外壳和识别分子4 ‑硝 基苯硫酚构成的核 ‑分子‑壳结构的金纳米花探 针； 内标修饰分子是具有腈基、 炔基或叠氮官能 团的拉曼信号分子。 本发明以拉曼信号分子作为 内标修饰分子修饰在金纳米球内核上， 校正后的 工作曲线重现性好， 误差小， 提高了检测结果的 可靠性； 通过内标修饰分子的分子层上生长一层 花瓣状金纳米外壳提高了SERS基底内部和外部 的SERS活性， 并且花瓣状外壳增加了SERS基底的 表面积。 另外， 本发明的识别分子能够实现硫化 氢的比率拉曼检测， 有效降低背景信号的干扰， 提高了检测灵敏度。 权利要求书1页 说明书8页 附图7页 CN 115219429 A 2022.10.21 CN 115219429 A 1.一种内标辅助花瓣状SERS纳米探针， 其特征在于： 所述探针是由金纳米球内核、 内标 修饰分子、 花瓣状金纳米外壳和识别分子构成的核 ‑分子‑壳结构的金纳米花探针； 其中， 所 述内标修饰分子是具有腈基、 炔基或叠氮官能团的拉曼信号分子； 所述识别分子为4 ‑硝基 苯硫酚。 2.根据权利要求1所述的内标辅助花瓣状SERS纳米探针， 其特征在于： 所述内标修饰分 子为4‑巯基苯甲腈。 3.根据权利要求1所述的内标辅助花瓣状SERS纳米探针， 其特征在于： 所述金纳米球内 核的粒径为20～40  nm； 所述花瓣状金纳米外壳的厚度为3 0～50 nm。 4.一种内标辅助花 瓣状SERS纳米探针的制备 方法， 其特 征在于： 包括以下步骤： 第一步， 制备具有表面 等离激元共振效应的金纳米 球内核AuNPs； 第二步， 在金纳米球内核AuNPs上修饰一层内标修饰分子， 所述 内标修饰分子为拉曼信 号分子且具有腈基、 炔基或叠氮官能团； 第三步， 在内标修饰分子的分子层外生长一层花瓣状金纳米外壳， 获得含有内标修饰 分子掺杂的金纳米花， 将其作为SERS基底； 第四步， 在SERS基底表面修饰一层用于识别H2S的4‑硝基苯硫酚， 得到核 ‑分子‑壳结构 的内标辅助花 瓣状SERS纳米探针。 5.根据权利要求4所述的内标辅助花瓣状SERS纳米探针的制备方法， 其特征在于： 所述 第二步中的内标修饰分子为 4‑巯基苯甲腈， 其 修饰方法如下： 将AuNPs溶液的pH调节至9.0， 加入4 ‑巯基苯甲腈的乙醇溶液， 恒温搅拌3  h， 离心去除 未键合的4 ‑巯基苯甲腈， 用去离 子水将沉淀 重新分散得到4 ‑巯基苯甲腈 修饰的AuNPs溶 液。 6.根据权利要求5所述的内标辅助花瓣状SERS纳米探针的制备方法， 其特征在于： 所述 第三步具体包括： 将第二步获得的4 ‑巯基苯甲腈修饰的AuNPs与十六烷基三甲基氯化铵溶 液混合， 然后依次加入HAuCl4·3H2O和抗坏血酸， 反应结束后得到深蓝色的SERS基底—— Au@MPBN@Au  NFs溶液。 7.根据权利要求6所述的内标辅助花瓣状SERS纳米探针的制备方法， 其特征在于： 所述 第四步包括以下具体内容： 将Au@MPBN@Au  NFs溶液离心， 用去离子水洗涤 沉淀； 洗涤后加入 对4‑硝基苯硫酚， 室温下搅拌反应， 反应结束后离心， 将沉淀分散于HEPES缓冲液即得4 ‑NTP 修饰的内标辅助花 瓣状SERS纳米探针— —Au@MPBN@Au@4 ‑NTP。 8.权利要求1 ‑3任一项所述的内标辅助花瓣状SERS探针在检测样本中H2S和/或在以非 疾病诊断为目的 的活细胞内H2S成像中的应用。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115219429 A 2一种内标辅助花 瓣状SERS纳米探针及其制备方 法、 应用 技术领域 [0001]本发明涉及H2S的检测领域， 尤其是涉及一种内标辅助花瓣状SERS纳米探针， 还涉 及一种内标辅助花瓣状S ERS纳米探针的制备方法， 还 涉及内标辅助花瓣状S ERS纳米探针的 应用。 背景技术 [0002]H2S是继NO、 CO之后、 被确定为生物体内的第三个具有生物活性的气体信号分子。 H2S广泛分布于全身各处， 哺乳动物中的内源性H2S通常由L ‑半胱氨酸通过3 ‑巯基丙酮酸硫 转移酶 （3 ‑MST） 、 胱硫醚 ‑β‑合成酶 （CBS） 和胱硫醚 ‑γ‑解酶 （CSE） 的酶催化反应生成。 研究 表明， 生物体内H2S参与一系列的生理过程， 包括调节血管张力、 心肌收缩、 神 经传导、 胰岛 素分泌等； 另外， 异 常浓度水平的H2S也与一系列恶性疾病密切相关， 如阿尔茨海默症、 唐氏 综合症、 糖尿病和急性肾脏损伤等。 因而， H2S的定量检测对临床具有重要意 义。 [0003]近年来， 气相色谱法、 电化学法、 化学发光法和荧光法等， 已被开发用于检测H2S。 然而， 这些方法大多需要复杂的样品前 处理， 在前 处理过程中甚至会造成样品破坏， 进而严 重影响影响检测结果。 [0004]SERS具有实时、 快速、 无创、 灵敏性高、 无自发荧光、 不受光漂白影响等特点， 已经 成为检测生物分子和生物成像的最有效工具之一。 对H2S的检测来说， 开发出具有灵敏度 高、 特异性强、 稳定性好和抗干扰能力强的SERS纳米探针是将SERS技术用于H2S的实时、 高 灵敏度、 特异性检测的关键技 术。 [0005]目前， 基于H2S引起的一些特殊化学反应 （如叠氮基团的还原、 Ag和H2S的反应等） ， 一些SERS纳米探针已经被开发出来用于检测活细胞中的H2S。 [0006]Li等人报道了第一个用于检测H2S的SERS纳米探针——4 ‑乙酰氨基苯磺酰叠氮功 能化的金纳 米粒子 （记为AuNPs/4 ‑AA） 。 该探针基于叠氮基团被H2S还原成氨基， 通过SERS 光 谱变化快速响应H2S， 并以高灵敏度监测活体胶质瘤细胞中内源产生的H2S。 然而， 虽然叠氮 化物可以快速重新反应， 但叠氮化物衍生物往往是不稳定的， 在激光照射下容易会产生不 想要的副产品， 存在假阳性信号， 影响检测结果的可靠性， 在一定程度上限制了该探针的进 一步应用。 [0007]Wang等人设计了一种近红外激活的SERS纳米探针， 该探针根据H2S与Ag反应导致 的纳米探针SERS光谱变化来监测H2S在细胞和斑马鱼胚胎中 的分布。 然而， 尽管该纳米探针 显示出对H2S的高灵敏度， 但Ag外壳也很容易被细胞 中的活性氧破坏， 导致该探针的选择性 较差， 影响检测结果的可靠性。 [0008]另外， 申请人在科研过程中还发现， 现有SERS纳米探针大多是以单一绝对信号强 度进行H2S的定量检测， 由于环境条件中存在诸多引起信号强度波动的干扰因素， 导致该检 测方法的可靠性较低， 误差较大。 [0009]综上， 如何设计一种既对H2S表现出很好的选择性， 又具有很好的检测灵敏度， 还 能尽可能地减少外界干扰因素对信号的干扰以提高检测结果可靠性的SERS纳米探针对生说　明　书 1/8 页 3 CN 115219429 A 3