(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210872862.8 (22)申请日 2022.07.21 (71)申请人 三峡大学 地址 443002 湖北省宜昌市西陵区大 学路8 号 (72)发明人 徐冰　丁莉芸　潘志红　罗志会　 曾曙光　 (74)专利代理 机构 宜昌市三峡专利事务所 42103 专利代理师 王玉芳 (51)Int.Cl. G01N 21/31(2006.01) G01N 21/01(2006.01) C12Q 1/6886(2018.01) C12Q 1/6806(2018.01)C12N 15/113(2010.01) (54)发明名称 一种基于氧化石墨烯包覆的金纳米粒子的 光纤miRNA传感器、 材 料、 探头及其应用 (57)摘要 本发明公开了一种基于氧化石墨烯包覆的 金纳米粒子的光纤miRNA传感器、 材料、 探头及其 应用。 基于静电作用制备了GO ‑AuNPs复合粒子， 氧化石墨烯可以放大复合粒子的LSPR 效应， 增加 传感器的灵敏度和稳定性。 利用化学交联法将复 合材料固定在光纤传感探头表 面， 并结合光源和 光谱仪制备得到miRNA光纤传感器。 当固定在光 纤探头表面的GO ‑AuNPs‑RNA probe 1与目标 RNA、 GO‑AuNPs‑RNA probe 2发生杂交反应时， GO‑AuNPs粒子间距 离减小， 粒子的局域表面等离 子效应被影响， 其局域表面等离子峰位发生变 化。 本发明克服了传统方法耗时、 昂贵等缺点， 为 光纤LSPR传感器在生物医学诊断领域中的应用 奠定了基础。 权利要求书2页 说明书7页 附图5页 CN 115308144 A 2022.11.08 CN 115308144 A 1.一种基于氧化石墨烯包覆的金纳米粒子的光纤miRNA传感器， 传感器包含宽带光源、 Y型光纤、 光纤探头、 光谱仪， 其特征在于， 所述传感探头侧面涂覆有氧化石墨烯 ‑金纳米‑ RNA复合材料 （GO ‑AuNPs‑RNA probe） ， 光纤探头尾端涂覆有反射银镜； 光经Y型光纤进入光 纤传感探头， 激发探头侧 面的氧化石墨烯 ‑金纳米敏感材料产生局 域表面等离子体共振现 象。 2.根据权利要求1所述基于氧化石墨烯包覆的金纳米粒子的光纤miRNA传感器， 其特征 在于， 固定在光纤探头表面的GO ‑AuNPs‑RNA probe 1与目标miRNA、 GO ‑AuNPs‑RNA probe 2 发生杂交反应时， 氧化石墨烯 ‑金纳米复合粒子间距离减小， 粒子的局域表面等离子效应被 影响， 其局域表面 等离子峰位发生变化， 从而实现对目标RNA的检测。 3.根据权利要求1所述基于氧化石墨烯包覆的金纳米粒子的光纤miRNA传感器， 其特征 在于， 所述 光纤探头直径为125 ‑1000 μm； 所述光源为卤钨灯宽带光源， 工作波长： 360~1200 nm， 光谱仪工作波长为320~1050  nm。 4.根据权利要求1所述基于氧化石墨烯包覆的金纳米粒子的光纤miRNA传感器， 其特征 在于， 所述 光纤探头表面的氧化石墨烯 ‑金纳米‑RNA复合材 料通过化学交联法固定 。 5.一种光纤探头敏感材料， 其特征在于， 所述材料为GO ‑AuNPs‑RNA probe复合材料， 制 备过程包括： S1、 通过静电法制备得到氧化石墨烯包覆 的金纳米复合粒子， 金纳米粒子被包覆于氧 化石墨烯内部； S2、 RNA probe通过化学交联法利用巯基固定于氧化石墨烯包覆的金纳米复合粒子表 面得到GO‑AuNPs‑RNA probe复合材 料； 所述传感RNA  probe为GO ‑AuNPs‑RNA probe 1和GO‑AuNPs‑RNA probe 2， 分别只与目 标miRNA符合碱基互补配对原理， 彼此之间不符合碱基互补配对原理。 6.根据权利要求5所述光纤探头敏感材料， 其特征在于， 所述金纳米颗粒采用水相还原 法制备， 氧化石墨烯 （G O） 采用Hum mers法合成， G O‑AuNPs复合粒子具体包 含以下步骤： （1） 利用王水将实验中所需的玻璃器皿清洗干净， 用去离子水冲洗， 烘干备用； 反应环 境的清洁可以避免在AuNPs生长过程中导入杂质； （2） 在沸腾 的氯金酸溶液中加入柠檬酸三钠溶液， 观察到混合液颜色由淡黄色变为黑 色， 最后变为酒红色时， 继续反应， 以得到AuNPs； （3） GO‑AuNPs复合材料的制备步骤如下： 将合成的AuNPs溶液与GO溶液按照混合， 搅拌 得到GO‑AuNPs复合粒子， GO表面的含 氧基团会促进GO对AuNPs的包埋， 从而形成GO ‑AuNPs复 合粒子。 7.根据权利要求6所述光纤探头敏感材料， 其特征在于， 所述步骤 （2） 中， AuNPs粒径范 围为10‑70nm； 步骤 （3） 中， AuNPs与G O比值为 （1‑5） ： 1。 8.根据权利要求5所述光纤探头敏感材料， 其特征在于， 所述GO ‑AuNPs‑RNA probe复合 材料的制备步骤如下： 步骤一GO ‑AuNPs‑RNAp的制备： 将制得的GO ‑AuNPs溶液多次洗样后分散于PBS缓冲液 中， 将TCEP水溶液分别加入RNA  probe 1 和RNAp probe 2中以活化其端部的巯基， 将活化权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 115308144 A 2后的RNA probe加入G O‑AuNPs溶液中， 在室温下孵 育； 步骤二GO ‑AuNPs‑RNAp的盐化： 将NaCl  分别加入GO‑AuNPs‑RNA probe 1和GO‑AuNPs‑ RNA probe 2溶液中， 超声后孵 育， 重复多次加入NaCl， 再继续孵 育； 步骤三洗样： 利用PBS对孵育液离心洗样， 除去溶液中未结合的RNA后分散于缓冲液PBS 中。 9.一种基于氧化石墨烯包覆的金纳米粒子的光纤miRNA传感器传感探头， 其特征在于， 光纤传感探 头的制备步骤如下： 步骤 （一） 将光纤表面硅烷化： 将光纤一端表面的有机包层去掉后， 记为光纤传感端即S 端， 将用丙酮、 酒精和去离子水清洗过的光纤S端插入HF酸溶液 （VHF:V水=1:1） 中腐蚀， 以增 强光纤外泄的消逝场； 将腐 蚀后的光纤清洗干净后， 插入pir anha溶液 （V过氧化氢:V硫酸= 3:7） 浸泡数小 时后， 浸泡时间范围可为2 ‑10小时， 将洗净的光纤置于110  ℃的真空干燥箱 中加热大约1h， 活化光纤表面的羟基； 之后， 将光纤S端在APTES溶液中浸泡数小 时， 使光纤 表面的羟基转 化为氨基； APTES的浓度为7% ‑11%， 浸泡时间为2 ‑10小时； 步骤 （二） GO ‑AuNPs在光纤上的固定： 将光 纤的S端浸泡在GO ‑AuNPs复合粒子溶液中， GO 的羧基会与光纤上的氨基发生结合， 从而会在光纤表面形成G O‑AuNPs复合粒子单层膜； 步骤 （三） 银镜反应封端： 通过银镜反应在经步骤二处理后的光纤S端的端面涂覆一层 银膜， 确保将光反射到光谱仪中； 步骤 （四） 用PBS缓冲液将RNA  probe1溶 液稀释得到RNA  probe1稀释液； 步骤 （五） 将 经步骤 （三） 处理后的GO ‑AuNPs功能化的光纤S端在RNA  probe 1 稀释液中 浸泡12 h， 使光纤表 面的GO‑AuNPs复合粒子与RNA  probe1通过共价键固定在一起； 之后， 用 无水乙醇和无核酸酶水冲洗掉 光纤表面未 结合的RNA分子； 步骤 （六） 利用BSA来钝化光纤表面没有结合GO ‑AuNPs复合粒子 的非特异性位点， 将光 纤S端在BSA溶液中浸泡； 步骤 （七） 得到用于检测miRNA ‑126的基于GO ‑AuNPs‑RNAp1的光纤LSPR  miRNA‑126传感 器。 10.权利要求1 ‑4任意一项所述的基于氧化石墨烯包覆的金纳米粒子的光纤miRNA传感 器传感或权利要求5 ‑8任意一项 所述光纤探头敏感材料或权利要求9所述探头用于RNA的定 量检测， 其特 征在于， 检测步骤如下： （1） 将等体积的GO ‑AuNPs‑RNAp2复合物与不同浓度的miRNA ‑126溶液混合， 并置于水浴 锅中加热， 然后自然冷却至室温， 并孵育一段时间， 使复合物与目标RNA之间的配对碱基充 分反应； （2） 将GO ‑AuNPs‑RNAp1功能化的光纤传感探头置于上述混合液中一段时间， 记录光纤 LSPR光谱图的变化； 每 个浓度下的样品重复试验三次， 完成检测。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 115308144 A 3