(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210857738.4 (22)申请日 2022.07.21 (71)申请人 合肥工业大 学 地址 230009 安徽省合肥市包河区屯溪路 193号 (72)发明人 曹璐璐　叶应旺　凌娜　沈益忠　 张丹凤　任玉伟　 (74)专利代理 机构 合肥金安专利事务所(普通 合伙企业) 341 14 专利代理师 金惠贞 (51)Int.Cl. G01N 21/64(2006.01) G01N 21/01(2006.01) (54)发明名称 一种基于氮硫共掺石墨烯量子点的荧光探 针对鼠伤寒沙门氏菌的检测方法 (57)摘要 本发明涉及一种基于氮硫共掺石墨烯量子 点的荧光探针对鼠伤寒沙门氏菌的检测方法， 属 于食品安全技术领域。 本发明基于夹心法策略， 利用核酸适配体修饰的链霉亲和素磁珠和氮硫 共掺石墨烯 量子点作为磁选探针和 信号探针； 当 待测物中含有鼠伤寒沙门氏菌时， 磁选探针和信 号探针同步特异性识别鼠伤寒沙门氏菌形成夹 心结构， 通过磁选作用使夹心结构被吸附， 取上 清液， 测定其在423nm处的荧光强度确定鼠伤寒 沙门氏菌浓度。 本发明实现同步识别鼠伤寒沙门 氏菌， 操作简便、 减小了样品基质影响、 成本低、 荧光特性稳定， 并由于在石墨烯量子点中掺杂 氮、 硫元素， 有效提高了石墨烯量子点的荧光量 子产率， 使检测灵敏度提高至11.9cfu/mL， 具有 良好的应用推广前 景。 权利要求书2页 说明书8页 附图2页 CN 115236050 A 2022.10.25 CN 115236050 A 1.一种基于氮硫共掺石墨烯量子点的荧光探针对鼠伤寒沙门氏菌的检测方法， 其特征 在于： 所用信号探针溶液是由氨基化适配体 （1） 修饰的氮硫共掺石墨烯量子点制成； 所述氨 基化适配体 （1） 的DNA序列为5 ′ ‑NH2‑(CH2)6‑TAT GGC GGC GTC ACC CGA CGG GGA CTT GAC  ATT ATG ACA G‑3′； 所用磁选探针溶液是由生物素化适配体 （2） 修饰的链霉亲和素磁珠制 成； 所述的生物 素化适配体 （2） 的DNA序列为5 ′ ‑Biotin‑GAG GAA AGT CTA TAG CAG AGG AGA TGT GTG AAC  CGA GTA A‑3′； 所用标准曲线： 横坐标X为鼠伤寒沙门氏菌菌液浓度 （cfu/mL） 的对数值， 纵坐标Y为I0‑ I， 所述I0为检测空白对照溶液时在423n m处的荧光强度， 所述I为检测102、 103、 104、 105、 106、 107cfu/mL的鼠伤寒沙门氏菌溶 液时在423nm处的荧 光强度； 具体检测操作步骤如下： （1） 待检液的制备 取1mL的液态乳， 以8000 ×g离心5min， 弃去上清液， 用1mL浓度为0.1M、 pH值7.4的无菌 PBS缓冲液重悬沉淀获得待检液； （2） 检测 （2.1） 在500μL待检液中加入100μL信号探针溶液和36μL磁选探针溶液， 在37℃条件下 孵育45min， 得到复合溶 液； （2.2） 将复合溶 液置于磁力架上进行磁分离， 取 上清液， 得到待测溶 液； （2.3） 取上述待测溶液于石英比色皿中， 设定棱光F97Pro荧光分光光度计的激发波长 为349nm， 测定待测溶 液在423nm处的荧 光强度； （3） 计算检测结果 将I0‑I值代入到标准曲线中， 计算得出待测溶液中的鼠伤寒沙门氏菌浓度， 即完成检 测； 其中， I0为检测空 白对照溶液时在423nm处的荧光强度， I为检测待测溶液时在423nm处 的荧光强度； 当I0‑I值大于104时， 表明被测物中检出鼠伤寒沙门氏菌； 当I0‑I值小于10 4时， 表明被测物中未检出鼠伤寒沙门氏菌 。 2.根据权利要求1所述的一种基于氮硫共掺石墨烯量子点的荧光探针对鼠伤寒沙门氏 菌的检测方法， 其特 征在于： 所述信号探针溶 液的制备操作步骤如下： （1） 取0.1mL氮硫共掺石墨烯量子点原液加入到9.9mL的超纯水中， 获得10mL的氮硫共 掺石墨烯量子点水 溶液； （2） 向10mL的氮硫共掺石墨烯量子点水溶液中加入5mg  N‑羟基琥珀酰亚胺和10mg  1‑ (3‑二甲氨基丙基) ‑3‑乙基碳二亚胺盐酸盐， 用浓度10mg/mL的氢氧化钠 （NaOH） 溶液调节pH 值至5.0， 在室温下避光孵 育30min， 获得活化的氮硫 共掺石墨烯量子点水 溶液； （3） 取上述活化的氮硫共掺石墨烯量子点水溶液， 用浓度10mg/mL的氢氧化钠 （NaOH） 溶 液调节pH值至7.4， 加 入20 μL浓度100 μM的氨基化适配体 （1） 溶液， 在室温下悬浮2h， 获得信 号探针溶 液。 3.根据权利要求2所述的一种基于氮硫共掺石墨烯量子点的荧光探针对鼠伤寒沙门氏 菌的检测方法， 其特 征在于， 所述氮硫 共掺石墨烯量子点原液的制备操作步骤如下： （1） 将1.0g柠檬酸与0.3g  L‑半胱氨酸混合均匀， 获得反应混合物；权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 115236050 A 2（2） 将反应混合物用油浴锅加热至200℃， 使其液化， 反应混合物液体的颜色由淡黄变 为橙色时停止加热， 自然冷却至室温， 获得橙色产物； （3） 将橙色产物溶解到10 0mL的超纯 水中， 获得氮硫 共掺石墨烯量子点原液。 4.根据权利要求1所述的一种基于氮硫共掺石墨烯量子点的荧光探针对鼠伤寒沙门氏 菌的检测方法， 其特 征在于： 所述磁选 探针溶液的制备操作步骤如下： （1） 取18μL浓度10mg/mL的链霉亲和素磁珠于硅化离心管中， 加入72μL的1 ×B&W缓冲 液， 混匀， 置于磁力架上静置1min， 待链霉亲和素磁珠被充分吸附在离心管管壁上， 弃去上 清液； 再加入72 μL的1 ×B&W缓冲液重复上述操作， 获得处 理的链霉亲和素磁珠； （2） 将处理的链霉亲和素磁珠重悬至36 μL的2 ×B&W缓冲液中， 加入36 μL浓度1.5 μM的生 物素化适配体 （2） 溶液， 在室温条件下孵 育30min， 获得偶联 液； （3） 将偶联液置于磁力架上， 静置1min， 弃去上清液， 加入50μL质量浓度1%的牛血清蛋 白 （BSA） 溶 液， 在室温条件下孵 育30min， 获得封闭偶联 液； （4） 将封闭偶联液置于磁力架上， 静置1min， 弃去上清液， 将沉淀重悬于36 μL浓度0.1M、 pH值7.4的无菌PBS缓冲液中， 得到磁选 探针溶液。 5.根据权利要求4所述的一种基于氮硫共掺石墨烯量子点的荧光探针对鼠伤寒沙门氏 菌的检测方法， 其特征在于： 所述1 ×B&W缓冲液由2 ×B&W缓冲液加入等体积超纯水稀释获 得； 所述2×B&W缓冲液的制备操作步骤如下： 称取0.1211g三羟 甲基氨基甲烷 （Tris） 、 11.7g氯化钠 （NaCl） 和0.0372g乙二胺四乙酸 （EDTA） ， 加入去离子水充分搅拌溶解， 用浓度36.5mg/mL的盐酸 （HCl） 溶液调节pH值至7.5， 搅拌均匀， 定容至100mL， 经121℃高压灭菌15min， 冷却， 得到2 ×B&W缓冲液， 于4℃冰箱保存 备用。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 115236050 A 3