(19)国家知识产权局
(12)发明 专利申请
(10)申请公布号
(43)申请公布日
(21)申请 号 202211018274.4
(22)申请日 2022.08.24
(71)申请人 北京大学
地址 100871 北京市海淀区颐和园路5号
(72)发明人 陈兴 刘嘉琳
(74)专利代理 机构 北京纪凯知识产权代理有限
公司 11245
专利代理师 吴爱琴
(51)Int.Cl.
G01N 30/02(2006.01)
G01N 30/06(2006.01)
G01N 30/72(2006.01)
(54)发明名称
Click-iG: 一种多类型完整糖肽的鉴定方法
(57)摘要
本发明公开了Click ‑iG: 一种多类型完整糖
肽的鉴定方法, 具体是利用非天然糖代谢标记技
术, 在细胞或活体组织样品中多种类型糖基化修
饰蛋白的聚糖链上引入一个叠氮基团, 然后通过
生物正交的点击化学反应, 使糖蛋白的聚糖链上
连接有生物素基团标签, 随后将蛋白酶解为肽
段, 再通过链霉亲和素 ‑生物素相互作用对糖基
化 修 饰 肽 段 进 行 富 集 ,最 后 通 过 基 于
sceHCDpdEThcD碎 裂技术的静电轨道离子阱高分
辨质谱进行质谱鉴定, 并使用pGlyco3软件进行
搜库分析。 所述的方法流程具有鉴定糖基化修饰
种类多、 修饰位点信息与糖链组成信息完全、 鉴
定覆盖度高等优点, 可以对复杂生物样品的N ‑糖
基化、 黏蛋白型O ‑糖基化和O ‑GlcNAc糖基化完整
糖肽进行统一鉴定, 从而实现对同一样品中多类
型糖基化修饰组学的综合研究。
权利要求书2页 说明书11页 附图6页
CN 115420821 A
2022.12.02
CN 115420821 A
1.Click‑iG: 一种多类型完整糖肽的鉴定方法, 包括如下步骤:
1)对待鉴定细胞或组织样品进行非天然糖代谢标记, 即, 将叠氮基团整合到多种类型
糖基化修饰的聚糖结构中, 使样品中糖蛋白的聚糖链上 标记有叠氮基团;
2)蛋白提取并利用点击化学反应使糖蛋白的聚糖链标记上生物素基团;
3)对所提取的蛋白进行变性、 还原、 烷基化和胰蛋白酶 酶解, 使其消化 为肽段;
4)通过链霉亲和素 ‑琼脂糖小珠对所得肽段进行富集, 并在紫外光照射的条件下将其
释放、 收集;
5)对收集的糖肽进行基于sceHCDpdEThcD碎裂方法的LC ‑MS/MS检测, 最后通过pGlyco3
软件对质谱数据进行完整糖肽解析。
2.根据权利要求1所述的方法, 其特征在于: 步骤1)中, 所述待鉴定细胞或组织样品为
活细胞或活体组织样品;
步骤1)的操作为: 向细胞培养基或小鼠腹腔内加入或注射含有叠氮基团的单糖类似
物, 对细胞或活体组织样品的糖基化修饰蛋白进行聚糖标记, 使糖蛋白的聚糖链上标记有
可用于生物正交点击化学反应的叠氮基团。
3.根据权利要求2所述的方法, 其特征在于: 所述含有叠氮基团的单糖类似物具体可为
1,6‑Pr2GalNAz或1,6 ‑Pr2ManNAz。
4.根据权利 要求1或2所述的方法, 其特征在于: 步骤2)的操作为: 向步骤1)所得体系中
加入裂解液, 进行超声破碎、 离心吸取上清液, 获取裂解液; 在裂解液中加入炔基 ‑光切割‑
生物素探针、 CuSO4/BTTAA、 抗坏血酸钠, 反应, 使生物素连接到目标蛋白上, 向所得反应体
系中加入甲醇沉淀蛋白;
所述反应在室温下进行, 所述反应的时间为2 ‑3小时。
5.根据权利要求 4所述的方法, 其特 征在于: 所述炔基 ‑光切割‑生物素探针的结构式为
6.根据权利要求1 ‑5中任一项所述的方法, 其特征在于: 步骤3)的操作为: 将步骤2)得
到的蛋白沉淀用尿素复溶, 加入NH4HCO3, 加入二硫苏糖醇DTT, 还原反应; 向反应后的溶液中
加入碘乙酰胺IA A, 烷基化反应; 向反应后的溶 液中加入NH4HCO3, 加入胰蛋白酶, 酶解反应;
其中, 所述还原反应的温度为32 ‑37°, 时间为0.5 ‑1小时;
所述烷基化反应的温度为25 ‑29°, 时间为0.5 ‑1小时;
所述酶解反应的温度为32 ‑37°, 时间为16 ‑20小时。
7.根据权利要求1 ‑6中任一项所述的方法, 其特征在于: 步骤4)的操作为: 向酶解后所
得溶液中加入链霉亲和素 ‑琼脂糖小珠, 孵育; 离心, 吸除上清液; 将收集到的链霉亲和素 ‑
琼脂糖小 珠用甲酸溶液重悬后置于紫外光下照射, 释放糖肽; 离心, 收集上清液, 干燥, 得到
糖肽干粉;
其中, 所述孵 育在室温下进行, 所述孵 育在旋转下进行, 所述孵 育的时间为2 ‑3小时;
所述甲酸溶 液为0.1%(v/v)甲酸溶 液;权 利 要 求 书 1/2 页
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2所述紫外光下照射的时间为5 ‑15分钟。
8.根据权利要求1 ‑7中任一项所述的方法, 其特征在于: 步骤5)中, 用于肽段分离的色
谱柱为EasySpray 反向色谱柱; 填料为PepMapC18颗粒;
色谱系统装置为Di onexUltimate3 000RPLC纳喷雾系统;
质谱采集系统为OrbitrapFusionLumos质谱仪, 其串级质谱碎裂模式为阶梯能量高能
碰撞解离 ‑靶标离子激发‑电子转移解离(sceH CDpdEThcD);
阶梯能量高能碰撞解离 ‑靶标离子激发 ‑电子转移/高能碰撞解离(sceHCDpdEThcD)的
参数为: 归一 化碰撞能量(NC E)为20‑30‑40; EThcD的辅助激发能量(SA)为3 5;
色谱流动相A相为0.1%甲酸的水 溶液, B相为80%乙腈, 0.1%甲酸的水 溶液;
色谱流动相的梯度参数为: 0 ‑10min: B相从1%到7%; 11 ‑311min: B相从7%到35%;
311‑353min: B相从3 5%到44%; 353‑356min: B相从4 4%到99%;
质谱设置相关参数: 肽段母离子采集范围是350 ‑2000Th, 其中AGC设置为400000, 分辨
率设置为20 0m/z的条件下120 00。权 利 要 求 书 2/2 页
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专利 Click-iG:一种多类型完整糖肽的鉴定方法
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