(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202211087059.X (22)申请日 2022.09.07 (71)申请人 熙华 （太仓） 新药开发有限公司 地址 215000 江苏省苏州市太 仓市沙溪镇 昭溪路101号太 仓星药港 3号楼1楼 (72)发明人 权腾飞　谈伟锋　段泽琳　 (51)Int.Cl. G01N 30/02(2006.01) G01N 30/72(2006.01) (54)发明名称 一种三磷酸类化合物浓度液相质谱联用检 测方法 (57)摘要 本发明公开了一种三磷酸类化合物浓度液 相质谱联用检测方法， 以满足三磷酸化合物的半 定量和定量的生物样本分析检测； 液相部分的流 动相使用易挥发成分的缓冲盐体系并对流动相 的酸碱度进行控制， 以满足大部分三磷酸的检测 工作， 从而通过引入友好型的溶剂成分解决传统 流动相无法直接进入质谱的问题， 解决了三磷酸 传统方法干扰大的问题， 有效的提高了三磷酸化 合物液相方法的稳定性以及与质谱的兼容性， 并 通过计算机辅助有效解决了液相质 谱方法对三 磷酸化合物标准品的依赖 。 权利要求书1页 说明书7页 CN 115372518 A 2022.11.22 CN 115372518 A 1.一种三磷酸类化 合物浓度液相质谱联用检测方法， 其特 征在于， 包括如下步骤： S1.样品处 理； S2.采用液相色谱 ‑质谱联用仪对样品进行检测； 其中， 步骤S2中液相色谱条件为： 采用阴离子交换色谱柱； 流动相A为酸性流动相， 有机 相成分为20％～50％乙腈， 同时含有1～10mM的缓冲盐， 酸碱度通过加入甲酸进行调节， 控 制在4～6； 流动相B为碱性流动相， 有机相成分为20％～50％乙腈， 同时含有1～10mM的缓冲 盐， 酸碱度通过加入甲酸进行调节， 控制在9～10； 进样器温度为4℃； 进样量为2.0 μL； 流速 为0.4mL/min； 基于流动相A和流动相B的梯度洗脱 程序为0～ 0.50、 10～ 30％B， 0.50～2.50、 95％B， 2.5 0～3.50、 95％B， 3.5 0～3.51、 10～3 0％B， 3.51～5.0 0系统控制； 其中， 步骤S2中质谱条件为： 扫描方式为选择离子监测， 离子化模式为负离子模式， 离 子源为电喷雾离子源， 碰撞气压力中等， 帘气压力为25psi， 雾化气压力为40psi， 辅助气压 力为50psi， 喷雾电压为 ‑4500V， 雾化气温度为5 50℃。 2.根据权利要求1所述的一种三磷酸类化合物浓度液相质谱联用检测方法， 其特征在 于， 步骤S1 中， 样品湿冰环 境温度下融化后， 涡旋 混匀； 取定量样品至96孔板中； 向96孔板中 分别加入定量内标工作溶液， 加入定量ACN， 混合均匀， 加入定量水混匀； 将96孔板放入离心 机进行离心； 转移定量上清溶液至96孔板后， 吹干， 用定量水复溶； 震 荡， 然后将溶液转移到 进样板中进样。 3.根据权利要求1所述的一种三磷酸类化合物浓度液相质谱联用检测方法， 其特征在 于， 步骤S2中， 流动相A配制时， 按体积比取定量H2O至玻璃瓶中， 加入定量挥发性缓冲盐溶 液， 混匀， 用可挥发性 酸调节pH 至4.0‑6.0， 然后定量加入乙腈， 混匀后超声15分钟。 4.根据权利要求3所述的一种三磷酸类化合物浓度液相质谱联用检测方法， 其特征在 于， 步骤S2中， 流动相A配制时， 所述挥发性 缓冲盐为醋酸铵或甲酸铵， 可挥发性酸为甲酸或 乙酸。 5.根据权利要求1所述的一种三磷酸类化合物浓度液相质谱联用检测方法， 其特征在 于， 步骤S2中， 流动相B配制时， 按体积比例取定量H2O至玻璃瓶中， 加入定量挥发性缓冲盐 溶液， 混匀， 用可挥发性碱调节pH 至9.0‑11.0， 然后定量加入乙腈， 混匀后超声15分钟。 6.根据权利要求5所述的一种三磷酸类化合物浓度液相质谱联用检测方法， 其特征在 于， 步骤S2中， 流动相B配制时， 所述挥发性缓冲盐为醋酸铵或甲酸铵， 可挥发性碱为氨水。 7.根据权利要求1所述的一种三磷酸类化合物浓度液相质谱联用检测方法， 其特征在 于， 步骤S2中， 洗针液R0和R3配制时， 按体积比例取定量乙腈和定量H2O至玻璃瓶中， 加入定 量的氨水， 混匀。 8.根据权利要求1所述的一种三磷酸类化合物浓度液相质谱联用检测方法， 其特征在 于， 步骤S2中， 质谱检测时， 待测物的Q1为[M ‑1]， 其中Q1为母离子的质量数， M为待测物的单 一同位素分子量； 三磷酸化合物的子离子为二磷酸片段， 质荷比为159.0； 检测的离子对为 [M‑1]/159.0 。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115372518 A 2一种三磷酸类化合物浓度液相质谱联用检测方 法 技术领域 [0001]本发明涉及药物分析技术领域， 特别涉及 一种三磷酸类化合物浓度液相质谱联用 检测方法。 背景技术 [0002]三磷酸化合物作为一种高能代 谢产物， 主要代表有三磷酸腺苷(ATP)， 其合成主要 通过多种细胞途径产生， 最典型的如在线粒体中通过氧化磷酸化由ATP合成酶合成。 ATP合 成的主要能源为葡萄糖和脂肪酸， 人体中每天的能量需要水解200 ‑300摩尔的ATP， 且ATP不 能被存储， 合成的ATP短时间内会被消耗 掉。 [0003]体内或细胞内的ATP检测一般采用电泳法、 光学分析法、 层析法三种方法， 其中层 析法包含纸电泳法、 凝胶电泳法、 毛细管电泳 法， 光学分析法包含分光光度法、 生物发光法， 层析法包含纸层析、 薄层层析法、 离子交换色谱法、 高效液相色谱法， 检测原理一般为发光 基团。 [0004]三磷酸类的药物目前主要是针对于抗病毒的领域。 三磷酸类化合物作为药物治疗 的有效成分一般是通过药物经过体内的代谢形成， 比较成功的药物有吉西他滨和索非布 韦， 药物进入体内后首先代谢形成单磷酸代谢物， 然后在磷酸化酶的作用下形成二磷酸的 中间状态， 随后形成三磷酸的高能代谢物形态。 其中， 索非布韦吸收后在肝脏内先代谢成三 磷酸尿嘧啶类似物(尿苷 三磷酸类似物)， 三磷酸尿嘧啶类似物可以掺入到HCV  RNA链中， 并 “假扮”成病毒复制时需要的核苷三磷酸 “掺合”到新生病毒RNA链中， 与丙肝病毒复制所需 的NS5B聚合酶发生竞争性结合， 用假 “核苷”代替了病毒复制所需的真 “核苷”以形成错误的 病毒RNA模板， 从而导 致病毒RNA 链的延长提前中止， 丙肝病毒复制也因此被终止 。 [0005]由于三磷酸化合物合成成本高， 合成周期长， 对于半定量和定量质谱检测研究来 说， 测定生物样本中三磷酸代谢物的浓度时， 需要获得一定数量和纯度的三磷酸标准品来 进行液相质谱条件的优化和质谱条件的摸索； 三磷酸化合物在合成过程中具有需要高温强 酸、 反应周期 长、 反应条件对环境不友好等不利因素， 特别 在前期候选化合物筛选过程中会 很大程度的降低研发效率， 增 加研发成本， 不利于快速 筛选出有潜力的候选化 合物。 [0006]其中， 采用常规的液相方法用于测定生物样本中三磷酸代谢物的浓度时， 由于三 磷酸类化合物的结构特点， 在常规的反相色谱柱中具有无保留、 色谱峰拖尾、 残留大的特 点， 同时很多液相条件与质谱体系不兼容， 比如离子对试剂： 三乙胺和六氟异丙醇试剂， 此 类试剂会抑制化 合物的信号影响质谱的适用寿命等比例因素。 [0007]而采用常规的质谱方法测定生物样本中三磷酸代谢物的浓度时， 常规质谱条件的 摸索需要配制三磷酸化合物的标准品， 配置成储备液进行质量数和二级碎片离子的寻找， 结合三磷酸化合物的合成成本高， 对于筛选阶段的质谱方法， 常规的生物分析方法开发途 径对合成部门的依赖较大。 [0008]基于上述分析， 若 目标检测物为生物基质中的三磷酸化合物， 生物基质中存在很 多其他的三磷酸内源物质可能对目标检测物的检测存在干扰， 造成检测结果不准确； 对于说　明　书 1/7 页 3 CN 115372518 A 3