(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210918827.5 (22)申请日 2022.08.02 (71)申请人 云谱康 （大连） 生物科技有限公司 地址 116085 辽宁省大连市高新 技术产业 园区信达街57号生命科学产业园2号 楼 (72)发明人 吴泽明　尹沛源　 (74)专利代理 机构 沈阳科苑专利商标代理有限 公司 210 02 专利代理师 马驰 (51)Int.Cl. G01N 30/02(2006.01) G01N 30/06(2006.01) G01N 30/72(2006.01) G01N 30/88(2006.01) (54)发明名称 一种代谢物组合及应用和检测试剂盒与使 用 (57)摘要 本发明涉及羊水小分子代谢物L ‑谷氨酰胺 和L‑谷氨酸作为标志物组合制备用于产前胎儿 结构异常诊断的检测试剂盒的新应用。 本发明还 涉及用于胎儿结构异常辅助诊断的检测试剂盒， 通过液相色谱质 谱法检测受试者羊水中上述两 种氨基酸的浓度值， 计算L ‑谷氨酰胺/L ‑谷氨酸 的浓度比， 与诊断模型的最佳截断值相比较， 从 而诊断受试者是否为胎儿结构异常。 所述两种代 谢物组合的联合应用对于产前超声胎儿结构异 常具有良好的辅助诊断效果。 本发 明所述检测试 剂盒具有诊断特异性与灵敏度高、 标志物组合简 单、 质谱法测定准确、 报告结果快、 检测成本低等 特点， 有助于与超声筛查和遗传学检测形成互 补， 提高妇产科临床上胎儿结构异常的诊断准确 性。 权利要求书2页 说明书19页 附图1页 CN 115326953 A 2022.11.11 CN 115326953 A 1.一种代谢物组合， 为用于产前胎儿结构异常辅助诊断的羊水代谢物组合， 包括L ‑谷 氨酰胺和L ‑谷氨酸。 2.代谢物组合物在制备用于产前胎儿结构异常辅助诊断的检测试剂盒的应用， 或， 代 谢物组合物在用于产前胎儿结构异常诊断的检测试剂盒的应用， 代谢物组合物包括L ‑谷氨 酰胺和L‑谷氨酸。 3.一种用于产前胎儿结构异常辅助诊断的检测试剂盒， 所述试剂盒包括： 1)定量液： 用于建立内标法定量工作曲线， 是同时含外标物(在建立内标法定量工作曲 线时， 不同的外标物分别各自独立地在1～10000ng/mL(优选20～2000ng/mL)区间范围内选 择3～15个不同的浓度点)和内标物(在建立内标法定量工作曲线时， 不同的内标物分别各 自独立地在5～500ng/mL区间范围内选择一个浓度点)的一系列甲醇和 /或乙腈的水溶液， 溶液中甲醇和/或乙腈的体积比在5～100％之间， 其中外标物是L ‑谷氨酰胺、 L ‑谷氨酸， 所 述外标物分别用于受试者待检羊水中L ‑谷氨酰胺、 L ‑谷氨酸的浓度定量和/或定性鉴定； 内 标物是氘代谷氨酰胺 ‑d5、 氘代L ‑谷氨酸‑d5， 浓度分别为5～500ng/mL， 所述内标物分别用 于受试者待检羊水中L ‑谷氨酰胺、 L ‑谷氨酸的浓度定量； 2)提取液： 甲醇和/或乙腈溶液(溶液采用的溶剂中甲醇的体积比是0～ 100％)， 用于受 试者待检羊水样本的预处 理； 3)稀释液： 甲醇和/或乙腈的水溶液或水溶液(溶液采用的溶剂中甲醇和/或乙腈的体 积浓度是0～10 0％)， 用于受试者待检羊水提取 液的稀释； 4)内标液： 含内标物氘代谷氨酰酸 ‑d5、 氘代谷氨酸 ‑d5的甲醇和/或乙腈溶液(溶液采 用的溶剂中甲醇的体积比是0～10 0％)， 内标物浓度分别为5 0～20000ng/mL。 4.按照权利要求3所述的检测试剂盒， 还包括三块微孔板： 分别为一、 二和三号微孔板， 其中一号微孔板是用于受试者待检羊水样本提取的24～96孔微孔板， 其中每孔的容量为 500～2000 μL； 二号微孔板是用于稀释受试者待检羊水提取物的2 4～96孔微孔板， 其中每孔 的容量为100～1000 μL； 三号微孔板是用于待检羊水样本稀释液上机检测的24～96孔微孔 板， 其中每孔的容 量为100～1000 μL。 5.按照权利要求3或4所述的检测试剂盒， 使用方法是： 1)1份或2份以上的待检羊水样本(若为冷冻的待检羊水样本首先要于室温下解冻)逐 份分别转移5～500 μL受试者 羊水至一号微孔板的1个或2个以上的不同微孔中， 每孔中分别 加入5～50 μL内标液和20～1500 μL提取液(为确保后续涡旋时液体不溅洒， 优选的体系的总 体积需低于或等于单孔容积的70％)， 1200～2000rpm、 2～5min涡旋振荡后(rpm表示转速单 位： 转/分钟)， 40 00～6000rpm、 10～6 0min离心除蛋白， 得羊水提取物； 2)分别一一转移10～500μL羊水提取物至二号板的1个或2个以上的不 同微孔中， 每孔 加入10～500 μL稀释液(为确保后续涡旋时液体不溅洒， 优选的体系的总体积需低于或等于 单孔容积的70％)， 12 00～2000rpm、 2～ 5min涡旋振荡后， 4000～ 6000rpm、 10～ 60min离心再 次去除蛋白， 得羊水提取物稀释液； 3)分别一一转移20～800μL羊水提取物稀释液至三号板的1个或2个以上的不同微孔 中， 得经处理后的受试者待检羊水样本， 备 液相色谱质谱法上机检测。 6.按照权利要求3或5所述的羊水检测试剂 盒， 所述的定量液和经处理后的受试者待检 羊水样本经液相色谱质谱法检测， 比较定量液(1～10000ng/mL， 优选20～2000ng/mL之间任权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 115326953 A 2一浓度点)中外标物L ‑谷氨酰胺、 L ‑谷氨酸与受试者待检羊水质谱扫描记录的色谱峰的保 留时间， 保留时间相差 ±0.05分钟以内， 即判断该色谱峰为受试者待检羊水中检测 到的两 个代谢物的色谱 峰， 实现对受试者待检羊水中两个检测目标代谢物的定性鉴定； 比较任一 浓度点(5～500ng/mL之间任一浓度点)定量液中内标物氘代谷氨酰胺 ‑d5、 氘代谷氨酸 ‑d5 与受试者待检羊水质谱扫描记录的色谱峰的保留时间， 保留时间相差 ±0.05分钟以内， 即 判断该色谱峰为两个内标物的色谱峰， 实现对受试者待检羊水中 内标物的定性 鉴定； 记录定量液和受试者待检羊水中L ‑谷氨酰胺与氘代谷氨酰胺 ‑d5各自的峰面积值、 谷 氨酸与氘代 ‑谷氨酸d5各自的峰面积值， 分别计算L ‑谷氨酰胺与氘代谷氨酰胺 ‑d5、 L‑谷氨 酸与氘代 ‑谷氨酸d5之间的峰面积比值， 以定量液中外标物浓度值为X， 以前述比值为Y， 分 别绘制L‑谷氨酰胺、 L ‑谷氨酸定量工作曲线并建立各自的定量工作方程； 分别将受试者待检羊水样本记录计算的前述峰面积比值代入方程得到质量浓度， 再经 过样本预处理体积折算和摩尔量换算， 即得到受试者待检羊水L ‑谷氨酰胺、 L ‑谷氨酸的浓 度值， 单位 μmo l/L， 并计算出L ‑谷氨酰胺/L ‑谷氨酸浓度比。 7.按照权利要求3或6所述的检测试剂盒， 以所述L ‑谷氨酰胺/L ‑谷氨酸浓度比和训练 集受试者的分类信息(结构异常组设定为 1， 正常对照组设定为0， 结构异常组受试者不低于 60例， 正常对照组受试者不低于30例， 构成训练集)绘制接受者操作特性曲线(以下简称： ROC曲线)， 按照ROC曲线中灵敏度与特异 性之和最大原则确定诊断模 型的最佳截断值(Cut ‑ off)。 8.按照权利要求7所述的检测试剂盒， 比较受试者L ‑谷氨酰胺/L ‑谷氨酸浓度比与截断 值的大小， 高于等于截断值则判断为结构异常阳性结果(结构异常)， 反之， 小于则为阴性结 果(结构正常)。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 115326953 A 3