(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210993968.3 (22)申请日 2022.08.18 (66)本国优先权数据 202210685069.7 202 2.06.16 CN (71)申请人 上海易算生物科技有限公司 地址 201101 上海市闵行区园文路28号310 室 (72)发明人 仝冰润　王晓庆　 (74)专利代理 机构 上海誉知恒专利代理事务所 (普通合伙) 31452 专利代理师 刘洁瑜 (51)Int.Cl. C12P 21/06(2006.01) C07K 1/14(2006.01) G01N 30/02(2006.01)G01N 30/06(2006.01) G01N 30/72(2006.01) (54)发明名称 一种低丰度蛋白富集试剂盒、 制备方法及应 用 (57)摘要 本发明公开了一种低丰度蛋白富集试剂盒、 制备方法及应用， 其包括： 磁性氧化石墨烯颗 粒、 磁珠清洗液、 裂解液、 还原烷基化试剂、 平衡液、 酶、 终止液以及脱盐柱； 其中， 所述磁性氧化石墨 烯颗粒接枝了至少一个功能基团。 本发明利用磁 性氧化石墨烯 边缘的羧基官能团， 通过共价修饰 完成氧化石墨烯的表面功能化， 再利用新官能 团 中的亲水氢键、 离子配位作用等， 用于对样本中 低丰度蛋白进行高效富集， 开发了一种低丰度蛋 白富集试剂盒。 此外， 针对富集下来的蛋白的后 续制备， 本发 明所述的低丰度蛋白富集试剂盒在 使用时， 相比传统制备流程至少需要24h， 本案的 流程仅3小时即可完成， 并可应用于几乎所有类 型样本的低丰度蛋白富集和质 谱检测前的样本 制备。 权利要求书2页 说明书9页 附图2页 CN 115449533 A 2022.12.09 CN 115449533 A 1.一种低丰度蛋白富集试剂盒， 其特征在于， 其包括： 磁性氧化石墨烯颗粒、 磁珠清洗 液、 裂解液、 还原烷基化试剂、 平衡液、 酶、 终止液以及脱盐柱； 其中， 所述磁性氧化石墨烯颗粒接枝了 至少一个功能基团。 2.根据权利要求1所述的低丰度蛋白富集试剂 盒， 其特征在于， 所述磁性氧化石墨烯颗 粒的粒径 为200～500nm， 颗粒核心 为氧化石墨烯/四氧化三铁构成， 颗粒外壳为经化学反应 接枝的功能基团， 所述功能基团包括氨基硫脲和磺酸基。 3.根据权利要求2所述的低丰度蛋白富集试剂 盒， 其特征在于， 所述磁性氧化石墨烯颗 粒的核心通过一 步沉淀法制备获得； 所述磁性氧化石墨烯颗粒的氧化石墨烯通过Marcan o改进的方法获得。 4.根据权利要求2所述的低丰度蛋白富集试剂 盒， 其特征在于， 所述氨基硫脲和磺酸基 与氧化石墨烯/四氧化 三铁的质量比为1： 1～ 2： 1， 优选地， 质量比为1： 1。 5.根据权利要求1～4中任意一项所述的低丰度蛋白富集试剂盒， 其特征在于， 所述磁 珠清洗液通过以下配置获得： 加入10mM Tris， pH为7.4， 随后加入15 0mM KCl， 加入质量浓度为0.0 5％CHAPS即可； 裂解液为1％S DC、 0.1M的尿素， 优选 0.1M尿素； 还原烷基化试剂包括： 还原试剂DTT或TCEP， 优选为5 ‑20mM TCEP； 以及 烷基化试剂CAA， 优选为10 ‑40mM CAA； 酶为胰蛋白酶或者胰蛋白酶与重组赖氨酸酶混合物， 优选为胰蛋白酶与重组赖氨酸每 混合物； 终止液为10v/v％TFA； 脱盐柱的填料为C18。 6.一种制备如权利要求1 ‑5中任意一项所述的低丰度蛋白富集试剂盒的制备方法， 其 特征在于， 所述制备 方法包括如下步骤： 制备获得氧化石墨烯， 并对氧化石墨烯表面进行功能化， 获得功能化基团接枝的石墨 烯； 将功能化基团接枝的石墨烯混合。 7.根据权利要求6所述的制备方法， 其特征在于， 制备磁性氧化石墨烯颗粒时具体包括 如下步骤： 制备获得氧化石墨烯， 将所获得的氧化石墨烯进行一步沉淀法获得氧化石墨烯/四氧 化三铁； 对氧化石墨烯表面进行功能化， 获得氨基硫脲接枝磁性氧化石墨烯以及磺酸基接枝磁 性氧化石墨烯； 混合氨基硫脲接枝磁性氧化石墨烯以及磺酸基接枝磁性氧化石墨烯， 获得混悬液， 置 于磁力架， 静置去上清， 保留沉淀； 采用磁珠清洗液重悬所述沉淀得到重悬液， 置于混匀仪上震荡混匀5min， 清洗磁珠， 即 获得所述的磁性氧化石墨烯颗粒。 8.如权利要求1～5中任意 一项所述的低丰度蛋白富 集试剂盒在蛋白质组分析的应用。 9.如权利要求8所述的应用， 其特 征在于， 所述应用使用时， 包括如下步骤： 加样， 样本用量 为20～10 0 μl；权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 115449533 A 2使用试剂盒检测。 10.根据权利要求9所述的应用， 其特 征在于， 使用试剂盒检测时， 磁性氧化石墨烯的用量 为0.01～10 μg/ μl； 磁珠清洗液使用时： 可选360度旋转混匀或者金属浴震荡混匀， 优选金属浴震荡混匀， 转速1000‑1200rpm， 温度为25～37℃， 优选 37℃； 孵育时间为3 0～120mi n， 优选60min； 还原烷化试剂使用时， 温度为80 ‑95℃， 优选95℃； 时间为5 ‑10min， 优选5min； 转速为 800‑1200rpm， 优选10 00rpm； 酶添加时， 胰蛋白酶与样品的质量比为1:10 ‑1:20， 重组赖氨酸酶与样品的质量比为1: 50‑1:100； 酶解的温度为37 ‑56℃， 优选 37℃； 酶解的时间为3 0‑120min， 优选120mi n； 终止液使用时， 溶液体系pH小于等于3， 离心力为12000RCF， 温度为常温， 时间为2～10 分钟。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 115449533 A 3