(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202211087634.6 (22)申请日 2022.09.07 (71)申请人 拉萨海关技 术中心 地址 851400 西藏自治区拉萨市北京西路 28号 申请人 福州海关技 术中心 (72)发明人 王君　曹晓钢　唐庆强　杨方　 (74)专利代理 机构 福州元创专利商标代理有限 公司 35100 专利代理师 林文弘　蔡学俊 (51)Int.Cl. G01N 30/02(2006.01) G01N 30/72(2006.01) (54)发明名称 一种冬虫夏草及其制品中虫草素和虫草腺 苷含量的检测方法 (57)摘要 本发明公开了一种冬虫夏草及其制品中虫 草素和虫草腺苷含量的检测方法， 包括以下步 骤： （1） 提取： 取冬虫夏草于耐压玻璃管中， 加入 甲醇溶液， 涡旋混匀后放入耐压腔体中， 充入氮 气使压力达到400  kPa后， 加热使其由室温升至 120℃， 再升至200℃保持10  min， 自然冷却至室 温， 取出提取液； （2） 含 量检测： 取提取液， 用甲醇 溶液转移至100  mL容量瓶中并定容至刻度， 摇 匀， 取10mL定容后的提取液于50  mL离心管， 加入 四氧化三铁负载的磁性纳米吸附材料， 涡旋混匀 后外加磁场分离得净化液， 然后进行液相色谱 ‑ 高分辨质谱检测； 本发明的方法配合超高效液相 色谱‑四级杆/静电场轨道阱高分辨质谱， 可以将 检测限达 到1μg/kg。 权利要求书1页 说明书6页 附图4页 CN 115436518 A 2022.12.06 CN 115436518 A 1.一种冬虫夏草及其制品中虫草素和虫草腺苷含量的检测方法， 其特征在于， 包括以 下步骤： （1） 虫草素和虫草腺苷提取： 取冬虫夏草或冬虫夏草制品于耐压玻璃管中， 加入体积分数为20  %的甲醇溶液， 涡旋 混匀30 s后， 放入耐压腔体中， 密封腔体， 充入氮气使腔体内压力达到  400 kPa后关闭氮 气， 加热腔体， 使其在10  min内由室温升至120  ℃， 再以4  ℃/min的速率升至200  ℃并保持 10 min， 结束后腔体自然冷却至室温， 取 出提取液； （2） 虫草素和虫草腺苷含量检测： 取步骤 （1） 的提取液， 用体积分数为20  %的甲醇溶液转移至100  mL容量瓶中并定容至 刻度， 摇匀， 取10  mL定容后的提取液于50  mL离心管， 加入300  mg四氧化三铁负载的磁性纳 米吸附材料， 涡旋混匀 30 s后外加磁场分离， 得到净化液， 然后进行超高效液相色谱 ‑四级 杆/静电场轨道阱高分辨质谱检测。 2.根据权利要求1所述的冬虫夏草及其制品中虫草素和虫草腺苷含量的检测方法， 其 特征在于， 步骤 （2） 中四氧化三铁负载的磁性纳米吸附材料的制备方法为： 将纳米四氧化三 铁与乙二胺 ‑N‑丙基硅烷按质量比为2： 1充分混合后， 置于50  mL离心管中， 加入无水乙醇， 涡旋2 min混匀， 以1000~2000 W功率超声1h， 室温下静置1  h后， 3000~5000 r/min离心3~5  min， 弃去上清液， 将产物置于60  ℃下真空干燥4  h， 取出过150  μm筛网， 得到四氧化三铁负 载的磁性纳米吸附材 料。 3.根据权利要求1所述的冬虫夏草及其制品中虫草素和虫草腺苷含量的检测方法， 其 特征在于， 步骤 （2） 中液相色谱条件： 色谱柱： Inert  sustain‑C18、 100mm ×2.1 mm×3  µm； 柱温： 35 ℃； 流动相为水和甲醇； 流速0.2  mL/min； 采用体积分数为15%甲醇洗脱； 进样量10 μL。 4.根据权利要求1所述的冬虫夏草及其制品中虫草素和虫草腺苷含量的检测方法， 其 特征在于， 步骤 （2） 中高分辨质谱 条件： 可加热点喷雾离子源HESI， 阳离子检测模式； 鞘 气流 速： 28 L/min； 辅助气流速： 8  L/min； 吹扫气流速： 0  L/min； 喷雾电压： 32 00 V； 毛细管 温度： 275℃； 辅助气加热温度： 300  ℃； 扫描模式： 一级全扫描+数据依赖的二级扫描Full  scan+ ddms2， 母粒子扫描分辨率： 70000， 最大注入时间： 100ms， 扫描范围100  m/z～300  m/z， 子粒 子扫描分辨 率： 17500， 触发阈值： 1 ×105， 最大注入时间： 5 0 ms。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115436518 A 2一种冬虫夏草及其制品中虫草素和虫草腺 苷含量的检测方 法 技术领域 [0001]本发明属于冬虫夏草及其制品中有效成分提取和检测技术领域， 具体涉及一种冬 虫夏草及其制品中虫草素和虫草腺苷含量的检测方法。 背景技术 [0002]冬虫夏草 （Ophiocordyceps  sinensis） 属 于线虫草科线虫草属真菌， 是 我国名贵 中药材之一， 具有极高的市场价值和药用价值。 由于其稀缺性和高价值， 人们不断寻找其替 代品或制备成各种 虫草制品， 包括从冬虫夏草中分离出不同菌种， 经深层发酵后培养人工 菌丝体， 或将其超微粉碎后制成含片、 胶 囊等。 由于人工制造的虫草替代品或虫草制品可能 与天然的冬虫夏草存在差异， 人们通常使用虫草菌 真菌特有的标志 性成分——虫草素和虫 草腺苷， 来评价其市场价值和药用效果， 并拓展到鉴别假冒冬虫夏草等用途上。 由于冬虫夏 草中虫草素和虫草腺苷的含量大多在0.01  %左右， 人工替代品和制品中的含量可能更低， 而当前虫草及其制品中虫草素和虫草腺苷的检测方法大多 无法测定出如此低的含量， 并还 存在提取效率低、 有效成分损失大、 检测工序多时间长等问题， 如： NY/T 2116‑2012 《虫草制品中虫草素和腺苷的测定  高效液相色谱 法》 中规定了一 种以水为溶剂， 经超声提取后用高效液相色谱仪检测的方法。 该方法需在超声波仪中超声 提取3 h， 且测定范围为30  mg/kg~1000 mg/kg， 不仅操作时间长， 而且检测低限过高， 不能 满足当前对虫草制品中虫草素和虫草腺苷的检测要求。 [0003]CN108948115B和 CN104478978A的专利申请公开了一种使用酶解法提取蛹虫草腺 苷的方法。 此法操作步骤复杂， 不仅需进行精密的梯度干燥和2  h以上的酶提取操作， 且所 需的虫草样品就超过1  kg， 不适用于样品价 值极高的冬虫夏草检测。 [0004]CN102558265B的专利申请公开了一种 蛹虫草腺苷的提取方法， 该方法操作过程繁 琐， 需将虫草样品经低温超微粉碎后先进行反复冻融3~7次， 再进 行3次连续微波加热提取， 还需接种于 培养基中进行3 5天以上的培 养， 耗时巨大， 不利于推广和应用。 [0005]CN112007055A和 CN102321135B等专利主要公开了制备虫草素提取物和生产虫草 素标准品的方法， 其技术路线主要是利用树脂和高速逆流色谱分离纯化虫草素， 从而用于 制备虫草素标准品等用途， 与本发明研究 的用于冬虫夏草中虫草素和虫草腺苷检测用途的 前处理方法不同。 [0006]张铭雅等 （ “HILIC‑MS/MS技术同时检测蛹虫草中虫草素、 虫草酸、 腺苷和肌苷含量 的方法学 ”， 《生物加工过程》 ， 第17卷第4期， 2019年， 第430~436页） 中报道了一种用HILIC ‑ MS/MS测定虫草样品中多种物质的方法， 但未提供 所用的提取 方法。 [0007]黄兰芳等 （ “HPLC‑ESI‑MS测定冬虫夏草和蚕蛹虫草中腺苷和虫草素含量 ”， 《中国 中药杂志》 ， 第29卷第8期， 2004年， 第762~764页） 、 谢显珍等 （ “液相色谱 ‑电喷雾离子化 ‑质 谱测定蛹虫草子实体中腺苷含量 ”， 《光谱实验室》 ， 第26卷第3期， 2009年， 第631~634页） 和 杨钊等 （“冬虫夏草及其代用品中腺苷和虫草素的LC ‑MS‑MS定量分析研究 ”， 《中国中药杂 志》 ， 第32卷第19期， 2007年， 第2018~2020页） 报道了一种冬虫夏草中腺苷和虫草素的检测说　明　书 1/6 页 3 CN 115436518 A 3