(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 20221087915 0.9 (22)申请日 2022.07.25 (71)申请人 山东步长制药股份有限公司 地址 274000 山东省菏泽市中华西路3 69号 (72)发明人 李晔　刘峰　刘洋　宗时宇　张红　 孙婷婷　王春柳　龙凯花　 (74)专利代理 机构 西安佩腾特知识产权代理事 务所(普通 合伙) 61226 专利代理师 曹宇飞 (51)Int.Cl. G01N 30/02(2006.01) G01N 30/72(2006.01) (54)发明名称 一种参仙升脉口服液超高效液相检测方法 (57)摘要 本发明提供一种参仙升脉口服液超高效液 相检测方法， 该检测方法采用UHPLC ‑QExactive   Focus MS/MS技术手段， 本发明检测方法共鉴定 出160个化学 成分， 包括29个黄酮类成分， 24个有 机酸类成分， 21个生物碱类成分， 19 个萜类成分， 15个苯丙素类成分， 12 个皂苷类成分和40个其他 类成分； 其中6个化学成分(芦 丁、 补骨脂苷、 异补 骨脂苷、 补骨脂素、 异补骨脂素和补骨脂酚)。 本 发明检测方法能够对参仙升脉口服液的有效物 质成分进行快速有效的全面表征， 为该产品质量 控制及标准 提升提供参 考依据。 权利要求书1页 说明书17页 附图3页 CN 115266976 A 2022.11.01 CN 115266976 A 1.一种参仙升脉口服液超高效液相检测方法， 其特征在于， 所述检测方法包括以下步 骤： ⑴、 对照品溶液的制备： 称取芦丁、 补骨脂苷、 异补骨脂苷、 补骨脂酚、 补骨脂素、 异补骨 脂素对照品， 分别置于量瓶中， 加甲醇溶解并定容， 作为对照品贮备液； 再用甲醇将各对照 品贮备液稀释至适宜浓度， 即得； ⑵、 供试品溶液的制备： 取参仙升脉口服液， 用甲醇稀释至刻度， 摇匀， 滤 过， 即得； ⑶、 色谱检测条件为： 色谱柱： 十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂， 流动相采用甲醇(A)和 0.07～0.12％甲酸水(B)梯度洗脱， 洗脱程序为0～13min， 5％～60％A； 13～27min， 60％～ 95％A； 27～3 0min， 95％A， 流速 0.1～0.5mL ·min‑1， 进样量1～3 μL， 柱温25～3 5℃； ⑷、 质谱条件为： 离子源为加热电喷雾离子源(H ‑ESI)， 喷雾电压为3～5kV， 鞘气(N2)流 量30～50arb， 辅助气流量8～12arb， 辅助加热器温度330～370℃， 毛细管温度310～330℃， S‑lens射频水平45～55， 自动增益控制(AGC)100～110， 扫描方式采用正、 负离子Full  MS/ dd‑MS2模式， Fu llMS分辨率60000～80000， dd ‑MS2分辨率30000～40000； 扫描范围m/z100～ 2000， 碰撞能量20～8eV； ⑸、 数据处理： 根据质谱精确相对分子量信 息， 选择一级准分子离子峰质荷比实测值与 理论值误差小于5ppm的分子， 与参仙升脉口服液化学成分数据库信息进行匹配， 初步推测 化合物信息， 采用Xcalibur  2.0软件进一步对目标化合物色谱峰及其二级碎片 离子信息进 行提取， 并结合相关化学成分数据库和文献信息对目标化 合物进行鉴定和 确证。 2.如权利要求1所述检测方法， 其特征在于， 所述检测方法步骤 ⑴对照品溶液的制备中 对照品溶 液的浓度为0.5～ 2ug/ml。 3.如权利要求2所述检测方法， 其特征在于， 所述检测方法步骤 ⑴对照品溶液的制备中 对照品溶 液的浓度为1ug/ml。 4.如权利要求1所述检测方法， 其特征在于， 所述检测方法步骤 ⑵供试品溶液的制备 中， 所述甲醇稀释的倍数8～12倍。 5.如权利要求1所述检测方法， 其特征在于， 所述检测方法步骤 ⑶色谱检测条件为： 所 述色谱柱的型号 为： Thermo  Accucore aQ。 6.如权利要求1所述检测方法， 其特征在于， 所述检测方法步骤 ⑶色谱检测条件为： 流 动相采用甲醇(A)和0.1％甲酸水(B)梯度洗脱， 洗脱程序为0～13min， 5％～60％A； 13～ 27min， 60％～95％A； 27～3 0min， 95％A， 流速 0.3mL·min‑1； ， 进样量2 μL， 柱温3 0℃。 7.如权利要求1所述检测方法， 其特征在于， 所述检测方法步骤 ⑷质谱条件为： 喷雾电 压为3.5kV， 鞘气(N2)流量40arb， 辅助气流量10arb， 辅助加热器温度350℃， 毛细管温度320 ℃， S‑lens射频水平50， 自动增益控制(AGC)106， 扫描方式采用正、 负离子Full  MS/dd‑MS2 模式， Full MS分辨率70000， dd ‑MS2分辨率35000； 扫描范围m/z  120～1800， 碰撞能量30 eV、 50eV、 70eV。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115266976 A 2一种参仙升脉口服液超高 效液相检测方 法 技术领域 [0001]本发明涉及 一种参仙升脉口服液超高效液相检测方法， 属于中成药质量检测方法 领域。 背景技术 [0002]本发明所述药品为参仙升脉口服液， 该药品是山东步长制 药股份的独家品种。 国 家药品监督管理局批准文号为国药准字Z20080183(10ml)、 其主要由乙酰谷酰胺和中药材 红花组配而成配伍组成， 本申请人对该产品布局多件专利申请， 其申请号为： 200710019 161.5、 201010275244.2、 202010831085.3， 上述专利技术保护主题为： 该参仙升 脉中药组方配比、 临床治疗糖尿病新用途、 口服液挥发性 成分检测方法等。 目前该药品国家 质量标准为WS3 ‑065(Z‑010)‑2003(Z)， 该标准中以人参皂苷Rb1、 Re、 Rg、 盐酸麻黄碱、 补骨 脂素、 异补骨脂素、 淫羊藿苷、 原儿茶醛的薄层含量定性鉴别。 其中本品以每支含红参以人 参皂苷Rg1进行单指标成分含量检测。 [0003]参仙升脉口服液是我国第一个专门治疗 缓慢性心律失常的专利中成药， 具有温补 心肾， 活血化瘀的作用。 现代临床上常用于治疗轻、 中度窦房结心动过缓(心率>50次)和轻 度病态窦房结综合征不合并有室上性快速心律 失常的心肾阳虚， 寒 凝血脉证。 全方由红参、 淫羊藿、 补骨脂(盐炙)、 枸杞子、 麻黄、 细辛、 丹参、 水蛭等八味中药组成。 经查阅文献， 仅发 现参仙升脉口服液中单味药材的化学成分研究报道。 其中， 红参是经人参蒸制干燥而成， 主 要有效成分为人参皂苷， 其特有成分为人参皂苷Rg3； 淫羊藿有效成分主要为淫羊藿总黄酮 和淫羊藿多糖； 补骨脂主要成分为补骨脂素、 异补骨脂素、 补骨脂二氢黄酮等； 枸杞子活性 成分主要为多糖类； 麻黄主要成分为生物碱， 含有麻黄碱、 伪麻黄碱等； 细辛、 丹参、 水蛭的 主要成分分别为咖啡酰类、 丹参酮类、 水蛭素。 目前， 对于中药复方产品的研究多局限于方 中单一中药 的化学成分， 缺 乏对参仙升脉 口服液整体化学物质基础的系统研究。 然而对于 传统的中医药而言， 药物的临床疗效是中药复方中多种有效成分协同作用的共同结果， 单 一中药成分的分析并不能够体现中药复方的整体性和化学成分的复杂多样性。 然而单一的 指标质控成分并不能从整体上反应该中药复方制剂的内在质量， 因此有必要开展 该产品的 中药复方物质成分研究。 发明内容 [0004]本发明提供一种参仙升脉口服液超高效液相检测 方法， 该检测 方法采用UHPLC ‑Q  Exactive  Focus MS/MS技术手段， 经对照品比对确认， 本发明检测方法共鉴定出160个化学 成分， 包括29个黄酮类成分， 24个有机酸类成分， 21个生物碱类成分， 19个萜类成分， 15个苯 丙素类成分， 12个皂苷类成分和40个其他类成分； 其中6个化学成分(芦丁、 补骨脂苷、 异补 骨脂苷、 补骨脂素、 异补骨脂素和补骨脂酚)。 本发明检测方法能够对参仙升脉口服液 的有 效物质成分进 行快速有效的全面表征， 并进一步对 所鉴定成分进 行药味、 类别归属， 为参仙 升脉口服液的有效成分物质基础研究和质量控制提供参 考依据。说　明　书 1/17 页 3 CN 115266976 A 3