(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202211026578.5 (22)申请日 2022.08.25 (71)申请人 辽宁键凯科技有限公司 地址 124000 辽宁省盘锦市双台子区园区 街南、 工贸路西21 11020090140248号 (72)发明人 朱丹丹　贺娇　何平　赵宣　 (74)专利代理 机构 北京领科知识产权代理事务 所(特殊普通 合伙) 11690 专利代理师 张丹 (51)Int.Cl. G01N 30/02(2006.01) G01N 30/06(2006.01) G01N 30/74(2006.01) (54)发明名称 一种叠氮化物叠氮取代率的检测方法 (57)摘要 本发明公开了一种叠氮 化物的检测方法， 特 别是一种叠氮取代率的定量检测方法。 该方法采 用DBCO试剂(特别是DBCO ‑丁酸)作为衍生试剂来 检测药物中叠氮 基团， 进一步通过衍生化试剂的 减少量来定量叠氮基团的含量， 该方法准确性 高、 特异性强、 灵敏度高、 重复性好， 通过外标定 量计算方法， 在线性范围内更准确的检测了产品 叠氮的取代 率， 从而更好的解决样品叠氮取代率 检测问题及杂质控制问题， 可以对叠氮化物的控 制提供有力的辅助。 权利要求书3页 说明书8页 附图3页 CN 115436509 A 2022.12.06 CN 115436509 A 1.一种叠氮化物叠氮取代率的检测方法， 所述方法包括如下步骤： (1)使用式 Ⅰ所示化合物与待测样品进行衍 生化反应； (2)将步骤(1)所 得反应体系通过HPLC ‑UV进行检测； 其中， R1具有以下 结构： G1和G2独立地选自： 单键、 ‑O‑、‑S‑、‑(C＝O)‑、‑O(C＝O)O ‑、‑(C＝O)NH ‑、‑NH(C＝O) ‑、‑ NH‑、‑O(C＝O)‑、‑(C＝O)O‑、‑S(O)x‑， x为1或2； L1选自： C1‑12亚烷基、 n选自1‑10的整数； R2选自：‑H、 羟基、 羧基、 巯基、 硝基、 氨基、 C1‑6烷基， 其中， 步骤(1)所述待测样品中含有叠氮化物， 所述叠氮化物为Azide～(Amide～linker)～PEG～b～PLA， 其结构式为 n为聚乙二醇残基的聚合度， m为聚 乳酸残基的聚合度， PEG部分的分子量为4500～5500道尔顿； PLA部分的分子量为10000～ 20000道尔顿。 2.权利要求1所述的检测方法， 其特 征在于， 所述的L1选自C1‑6亚烷基， R2为‑COOH； 优选地， 所述 化合物具有如下 结构： 3.权利要求1所述的检测方法， 其特征在于， 所述的检测方法是通过高效液相色谱对叠 氮化物进行检测， 所述高效液相色谱的检测器为 紫外检测器， 色谱条件为： 所述高效液相色谱的色谱柱的固定相为 丁基硅烷键合硅胶； 所述色谱柱的长度为10 0～300mm；权　利　要　求　书 1/3 页 2 CN 115436509 A 2所述高效液相色谱的流动相包括流动相A和流动相B， 流动相A为三氟乙酸水溶液， 流动 相B为三氟乙酸的乙腈溶 液， 流动相A+流动相B＝10 0％； 所述流动相的流速为0.5～1.5mL/mi n； 所述色谱柱的柱温为3 0～50℃。 4.权利要求1所述的检测方法， 其特征在于， 所述流动相A的浓度为0.01～0.5％， 所述 流动相A中三氟乙酸与水的体积比为0.1～1:10 0。 5.权利要求1所述的检测方法， 其特征在于， 所述流动相B的浓度为0.01～0.5％， 所述 流动相B中三氟乙酸与乙腈的体积比为0.1～1:10 0。 6.权利要求3所述的检测方法， 其特征在于， 所述的高效液相色谱采用 梯度洗脱程序， 所述梯度洗脱程序如下： 洗脱时间为0分钟时， 流动相的体积浓度： 流动相A： 75～85％， 流动相B： 余 量； 洗脱时间为0～20分钟时， 流动相的体积浓度： 流动相A： 由75～85％梯度变化为35～ 45％， 流动相B： 余 量； 洗脱时间为20～25分钟时， 流动相的体积浓度： 流动相A： 由35～45％梯度变化为2～ 10％， 流动相B： 余 量； 洗脱时间为25～30分钟时， 保持等度洗脱， 流动相的体积浓度： 流动相A： 2～10％， 流动 相B： 余量； 洗脱时间为30～31分钟时， 流动相的体积浓度： 流动相A： 由2～10％梯度变化为75～ 85％， 流动相B： 余 量； 洗脱时间为31～40分钟时， 保持等度洗脱， 流动相的体积浓度： 流动相A： 75～85％， 流 动相B： 余 量； 优选的， 所述梯度洗脱程序如下： 洗脱时间为0分钟时， 流动相的体积浓度： 流动相A： 80％， 流动相B： 余 量； 洗脱时间为0～20分钟时， 流动相的体积浓度： 流动相A： 由80％梯度变化为40％， 流动 相B： 余量； 洗脱时间为20～25分钟时， 流动相的体积浓度： 流动相A： 由40％梯度变化为5％， 流动 相B： 余量； 洗脱时间为25～30分钟时， 保持等度洗脱， 流动相的体积浓度： 流动相A： 5％， 流动相 B： 余量； 洗脱时间为30～31分钟时， 流动相的体积浓度： 流动相A： 由5％梯度变化为80％， 流动 相B： 余量； 洗脱时间为31～40分钟时， 保持等度洗脱， 流动相的体积浓度： 流动相A： 80％， 流动相 B： 余量； 所述洗脱时间为20～6 0min(如20、 25、 3 0、 35、 40、 45、 5 0、 55、 60min)， 优选为3 0～50min。 7.权利要求1所述的检测方法， 其特征在于， 所述检测为定性检测或定量检测， 所述定 量检测为对叠氮基团含量的定量检测， 所述定量检测是通过衍生化前后式 Ⅰ所示化合物或 式Ⅱ所示化合物的减少量 来得到叠氮基团的含量。 8.权利要求7 所述的检测方法， 其特 征在于， 所述定量检测采用外标法进行。 9.式Ⅰ所示化合物作为 衍生化试剂在叠氮化物的检测中的应用，权　利　要　求　书 2/3 页 3 CN 115436509 A 3