(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210923639.1 (22)申请日 2022.08.02 (71)申请人 连云港金康和信药业有限公司 地址 222000 江苏省连云港市连云港经济 技术开发区金桥路南、 云桥路东 (72)发明人 仇峰　成永之　连增林　 (74)专利代理 机构 南京天华专利代理有限责任 公司 32218 专利代理师 徐冬涛　邢贤冬 (51)Int.Cl. G01N 30/02(2006.01) G01N 30/72(2006.01) G01N 30/06(2006.01) (54)发明名称 一种基于LC-MS/MS技术检测血浆中叶酸及 其衍生物浓度的方法 (57)摘要 本发明公开了一种基于LC ‑MS/MS技术检测 血浆中叶酸及其衍生物浓度的方法， 包括： 将叶 酸、 二氢叶酸、 四氢叶酸和5 ‑甲基四氢叶酸配制 混合标准溶液， 将混合标准溶液加入到空白血浆 中并加入 稳定剂， 再加入内标工作溶液， 涡旋， 离 心， 取上清液与稳定剂混合， 进行LC ‑MS/MS检测， 以待测物与内标峰面积的比值对其浓度做线性 回归， 得到标准曲线； 取待测血浆， 加入甲醇， 再 加入内标工作溶液和稳定剂， 涡 旋、 离心， 取上清 液与稳定剂混合， 进行LC ‑MS/MS检测， 记录待测 物与内标物对应的峰面积， 计算峰浓度比， 代入 标准曲线， 得到待测物的浓度。 本发明解决了生 物样品中叶酸类成分在分析中不稳定的问题， 提 高了准确性和可靠性。 权利要求书2页 说明书12页 附图4页 CN 115436502 A 2022.12.06 CN 115436502 A 1.一种基于LC ‑MS/MS技术检测血浆中叶酸及其衍生物浓度的方法， 其特征在于： 该方 法同时测定血浆中叶酸、 二氢叶酸、 四氢叶酸、 5 ‑甲基四氢叶酸的浓度， 包括： 步骤(1)、 标准曲线的制备： 将叶酸、 二氢叶酸、 四氢叶酸和5 ‑甲基四氢叶酸配制成不同 浓度的混合标准溶液， 将混合标准溶液加入到空白血浆中并加入稳定剂， 混匀， 再加入内标 工作溶液， 涡旋， 离心， 取上清液与稳定剂混合， 即为标准曲线样品溶液， 进样LC ‑MS/MS系 统， 按照液相色谱 ‑质谱联用检测条件进行LC ‑MS/MS检测， 记录待测物对应峰面积， 以待测 物与内标峰面积的比值对其浓度做线性回归， 得到相应的标准曲线； 步骤(2)、 待测血浆中叶酸、 二氢叶酸、 四氢叶酸、 5 ‑甲基四氢叶酸的测定： 取待测血浆， 加入甲醇， 再加入内标工作溶液和稳定剂， 涡旋、 离心， 取上清液与稳定剂混合； 进样LC ‑MS/ MS系统， 按照液相色谱 ‑质谱联用检测条件进行LC ‑MS/MS检测， 记录待测物与内标物对应的 峰面积， 计算峰浓度比， 代入标准曲线， 计算得到待测物的浓度； 其中， 液相色谱 ‑质谱联用检测条件： 液相色谱条件： C18反相色谱柱； 流动相A： 0.1％甲酸水溶液， 流动相B： 0.1％甲酸甲醇 溶液； 洗脱方式： 以等度梯度开始洗脱， 以95％ ‑98％流动相A洗脱不小于0.5min， 然后在不 大于1min内提升流动相B比例至100％， 100％流动相B持续洗脱不小于3min， 再将流动相比 例调整为初始梯度； 流速： 0.40 0～0.600mL/min； 质谱条件： 采用ESI源， 负离 子MRM模式检测； 所述的内标工作溶液是以苯妥英钠或同位素标记物C13‑5‑甲基四氢叶酸为内标物， 并 添加二硫苏糖醇、 抗坏血酸， 采用甲醇配制的内标 溶液。 2.根据权利要求1所述的基于LC ‑MS/MS技术检测血浆中叶酸及其衍生物浓度的方法， 其特征在于： 所述的稳定剂为 二硫苏糖醇和抗坏血酸的混合水 溶液。 3.根据权利要求1所述的基于LC ‑MS/MS技术检测血浆中叶酸及其衍生物浓度的方法， 其特征在于： 所述的内标工作溶液中， 内标物的浓度为60～80 μg/mL、 二硫苏糖醇 的浓度为 1mg/mL、 抗坏血酸的浓度为1mg/mL。 4.根据权利要求1所述的基于LC ‑MS/MS技术检测血浆中叶酸及其衍生物浓度的方法， 其特征在于： 所述的液相色谱条件： Agilent  Zorbax XDB C18色谱柱， 规格50mm ×2.1mm, 3.5 μm； 柱温： 室温； 流动相A： 0.1％甲酸水溶液； 流动相B： 0.1％甲酸甲醇溶液； 洗脱 方式： 以 98％流动相A洗脱0.5min， 然后再在0.5min内将流动相B比例提升至100％， 按100％流动相B 洗脱3min， 0.1min内将流动相比例调整为初始梯度并持续平衡色谱柱， 整个检测时间为 5min； 流速： 0.40 0mL/min； 进样量： 5 μL。 5.根据权利要求1或4所述的基于LC ‑MS/MS技术检测血浆中叶酸及其衍生物浓度的方 法， 其特征在于： 所述的洗脱方式： 0.00 ‑0.50min， 2％流动相B； 0.50 ‑1.00min， 2％ ‑100％流 动相B； 1.00 ‑4.00min， 100％流动相B； 4.00 ‑4.01min， 100％ ‑2％流动相B； 4.01 ‑5.00min， 2％流动相B。 6.根据权利要求1所述的基于LC ‑MS/MS技术检测血浆中叶酸及其衍生物浓度的方法， 其特征在于： 所述的质谱条件： ESI离子化源， 负离子扫描的MRM检测模式， 气帘气和雾化气 均使用氮气， 设定值分别 为20和10psi； 负离子模式下的源喷射电压设定为 ‑4500V， 叶酸的 离子对： m/z为440 →311， 碰撞能量为 ‑27eV； 二氢叶酸的离子对： m/z为442 →176， 碰撞能量 为‑33eV； 四氢叶酸的离子对： m/z为458 →286， 碰撞能量为 ‑33eV； 5‑甲基四氢叶酸的离子权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 115436502 A 2对： m/z为458→329， 碰撞能量 为‑36eV。 7.根据权利要求1所述的基于LC ‑MS/MS技术检测血浆中叶酸及其衍生物浓度的方法， 其特征在于： 步骤(1)中， 所述的混合标准溶液的配制： 取叶酸、 二氢叶酸、 四氢叶酸、 5 ‑甲基 四氢叶酸对照品， 以适量DMSO溶解， 分别配成浓度为1.00mg/ml的叶酸对照品储备液、 浓度 为1.00mg/ml的二氢叶酸对照品储备液、 浓度为1.00mg/ml的四氢叶酸对照品储备液、 浓度 为1.00mg/ ml的5‑甲基四氢叶酸对照品储 备液； 取上述4种对照品储 备液， 混合， 采用甲醇进 行系列稀释， 配制成不同浓度的混合标准溶 液； 标准曲线样品溶液的制备方法： 取50 μL空白血浆， 加入5 μL混合标准工作溶液， 涡旋5～ 10s， 再加入5 μL稳定剂， 涡 旋10s， 加入300 μL内标工作溶液， 涡旋不小于1min， 12000rpm离心 不少于10min， 取上清液， 将20 μL上清液与80 μL稳定剂混匀， 使得标准曲线样品溶液中二硫 苏糖醇和抗坏血酸的浓度不小于 0.9mg/mL。 8.根据权利要求1所述的基于LC ‑MS/MS技术检测血浆中叶酸及其衍生物浓度的方法， 其特征在于： 步骤(2)中， 上清液中二硫苏糖醇与抗坏血酸的浓度均不小于0.9mg/mL， 上清 液中内标物的浓度5～ 20 μg/mL。 9.根据权利要求1或8所述的基于LC ‑MS/MS技术检测血浆中叶酸及其衍生物浓度的方 法， 其特征在于： 取50 μL待测血浆， 加入5 μL甲醇， 涡旋5～10s， 再加入5 μL二硫苏糖醇和抗坏 血酸的浓度均为5mg/mL的稳定剂， 涡旋10s， 再加入300 μL内标物的浓度为60～80 μg/mL、 二 硫苏糖醇和抗坏血酸的浓度均为1mg/mL的内标工作溶液， 涡旋不小于1min， 12000rpm离心 不少于10min， 取20 μL上清液， 与80 μL稳定剂混匀， 使得样品溶液中二硫苏糖醇和抗坏血酸 的浓度不小于 0.9mg/mL。 10.权利要求1所述的方法在测定血浆中叶酸及其 衍生物浓度的应用。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 115436502 A 3