(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210909244.6 (22)申请日 2022.07.29 (71)申请人 国家烟草质量 监督检验中心 地址 450001 河南省郑州市高新区翠竹街６ 号６ 幢 申请人 中国科学院合肥物质科 学研究院 (72)发明人 王皓月　计敏　胡清源　罗彦波　 侯宏卫　陈欢　 (74)专利代理 机构 郑州中民专利代理有限公司 41110 专利代理师 黄宇亭 (51)Int.Cl. G01N 30/02(2006.01) G01N 30/06(2006.01) G01N 30/72(2006.01)G01N 30/86(2006.01) (54)发明名称 一种基于UHPLC-QTOF-MS的喉癌患者血清 脂 质组学检测方法 (57)摘要 本发明公开了一种基于UHPLC ‑QTOF‑MS的喉 癌患者血清脂质组学检测方法， 该方法包括以下 步骤： 1)取样， 采 集志愿者血清； 2)12种脂质标准 品分析方法的建立； 3)血清样品前处理及非靶向 脂质组学检测； 4)差异脂质的鉴定及统计学分 析。 本发明通过12种脂质标准品为探针以优化分 析方法并利用该方法完成了喉癌患者血清中的 脂质检测， 从脂质组学的角度阐明了喉癌脂质代 谢通路网络变化， 筛选到了关键差异代谢物， 为 喉癌候选生物标志提供了新的可能。 权利要求书2页 说明书14页 附图6页 CN 115266985 A 2022.11.01 CN 115266985 A 1.一种基于UHPLC ‑QTOF‑MS的喉癌患者血清脂质组学检测方法， 其特征在于： 包括以下 具体过程： 步骤一： 取样， 获取志愿者血清： 招募喉癌患者、 喉良性肿瘤患 者和健康人群， 对志愿者 进行筛选， 采集所有受试者的空腹血液； 将新鲜血液经预 处理离心得到血清， 分离与分装过 程在冰上进行， 所有样品通过 液氮速冻后于超低温冰箱 ﹣80℃保存； 步骤二： 针对12种脂质标准品建立分析方法： 将12种脂质标准品作为探针进行高效液 相色谱‑三重四级杆质谱(LC ‑MS)分析方法优化， 并完成方法学考 察； 步骤三： 血清样品前处理及非靶向脂质组学检测： 对不同组别的所有入选志愿者血清 进行样品前处理， 并通过步骤二已建立的分析方法， 用高效液相色谱 ‑飞行时间质谱 (UHPLC‑QTOF‑MS)平台进行 更为广泛的非靶向血清脂质组学检测； 步骤四： 差异脂质的鉴定及统计学分析： 进行多变量分析： 建立主成分分析(PCA)分析 模型， 观察样本和质控样本的分布； 建立正交偏最小二乘法判别分析(OPLS ‑DA)模型， 通过 置换分析观察模型的拟合程度， 并筛选出变量重要性投影(VIP)＞1的变量； 对样本中的代 谢物的显著性进行单变量分析， 结合多变量分析结果筛选出VIP>1， P<0.05的变量； 对可能 的差异脂质完成定性、 注释和生物学意 义分析。 2.根据权利 要求1所述的基于UHPLC ‑QTOF‑MS的喉癌患者血清脂质组学检测方法， 其特 征在于， 征集的志愿者分组包括 三组： 喉癌 患者、 喉良性肿瘤患者和健康人群。 3.根据权利 要求1所述的基于UHPLC ‑QTOF‑MS的喉癌患者血清脂质组学检测方法， 其特 征在于， 12种脂质标准品作为探针进行LC ‑MS分析方法优化的具体步骤如下： (1)质控(QC)样本前处理： QC样本是挑选喉癌患者、 喉良性肿瘤患者和健康人群三类受 试者各5例样 品， 每例样品吸取100 μL进行混合， 分别按照加标样品前处理流程和不加标前 处理流程进行处 理； (2)配制12种脂质标准品I级储备液、 混合脂质标准储备液、 混合 内标溶液、 12种脂质标 准品II级储备液与标曲工作液； (3)利用脂质标准品溶液进行色谱柱类型、 柱温、 流速和流动相梯度 条件优化以及质谱 条件优化； (4)LC‑MS测定加标QC样品和不加标QC样品， 完成检出限、 定量限、 线性范围、 精密度、 准 确度和回收率的方法学考 察。 4.根据权利要求1或3所述的基于UHPLC ‑QTOF‑MS的喉癌患者血清脂质组学检测方法， 其特征在于， 12种脂质标准品为： 三肉豆蔻酸甘油酯(TAG  14:0/14:0/14:0)、 1 ‑油酰基‑ rac‑甘油(MAG  18:1/0:0/0:0)、 1,2 ‑二油酰基 ‑sn‑甘油(DAG  18:1/18:1/0:0)、 二氢神经鞘 氨醇(SA d18:0)、 N ‑硬脂酰‑D‑神经鞘磷脂(SM  d18:1/18:0)、 1,2 ‑二(6Z‑油酰基)‑sn‑甘 油‑3‑磷酸胆碱(PC  18:1(6Z)/18:1(6Z))、 1 ‑棕榈酰‑2‑(9Z‑油酰基)‑sn甘油‑3‑磷酸胆碱 (PC 16:0/18:1(9Z))、 1 ‑棕榈酰‑sn‑甘油‑3‑磷酸胆碱(Lyso  PC 16:0/0:0)、 1 ‑葵酰‑sn‑甘 油‑3‑磷酸胆碱(L yso PC 19:0/0:0)、 1 ‑肉豆蔻酰 ‑sn‑甘油‑3‑磷酸胆碱(Lyso  PC 14:0/0: 0)、 1‑(9Z‑油酰)‑sn‑甘油‑3‑磷酸胆碱(Lyso  PC 18:1(9Z)/0:0)、 1 ‑油酰‑sn‑甘油‑3‑磷酸 胆碱(Lyso  PC 18:0/0:0)。 5.根据权利 要求3所述的基于UHPLC ‑QTOF‑MS的喉癌患者血清脂质组学检测方法， 其特 征在于， 12种脂质标准品I级储 备液的配制溶剂为二氯甲烷 ‑甲醇(2:1,v/v)混合溶液， 所有权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 115266985 A 2标准品浓度均为 1mg/mL； 12种脂质标准品II级储 备液与标曲工作液的配制溶剂为异丙醇溶 液。 6.根据权利 要求3所述的基于UHPLC ‑QTOF‑MS的喉癌患者血清脂质组学检测方法， 其特 征在于， 混合内标溶液采用的是Avanti  Polar Lipids公司开发的氘化标准混合物产品 EquiSPLASHTM 该内标混合物是商业化的单个浓度 为100 μg/mL的13种氘化脂 质内标的混合物(含15:0 ‑18:1(d7)PC、 18:1(d7)Lyso  PC、 15:0‑18:1(d7) ‑15:0TAG、 15:0 ‑ 18:1(d7)DA G、 18:1(d7)MA G、 d18:1‑18:1(d9)SM、 15:0 ‑18:1(d7)PE、 18:1(d7)Lyso  PE、 15: 0‑18:1(d7)PG(钠盐)、 15:0 ‑18:1(d7)PI(铵盐)、 15:0 ‑18:1(d7)PS(钠盐)、 18:1(d7)固醇 酯、 C15神经酰胺 ‑d7)， 溶剂为甲醇溶 液。 7.根据权利 要求1所述的基于UHPLC ‑QTOF‑MS的喉癌患者血清脂质组学检测方法， 其特 征在于， 步骤一中10例喉癌 患者、 10例喉良性肿瘤患者和10例健康患者入组。 8.根据权利 要求1所述的基于UHPLC ‑QTOF‑MS的喉癌患者血清脂质组学检测方法， 其特 征在于， 血清样本前处理过程为： 血清样品在4℃条件 下解冻2h， 将120 μL异丙醇加至40 μL血 清中， 涡旋样品后在室温下孵育10min， 将样 品放置﹣20℃下储存过夜， 以改善蛋白质沉淀， 然后于4℃， 14000 g离心20min。 收集上清液100 μL加入100 μL  2:98,v/v的乙腈/水溶液将水 含量调整为50％， 涡旋60s， 然后4℃， 14000g离心10min后取上清进行仪器 分析， 所有前处理 过程均在冰上操作。 9.根据权利 要求1所述的基于UHPLC ‑QTOF‑MS的喉癌患者血清脂质组学检测方法， 其特 征在于， 非靶向脂质组学检测中色谱条件为： 流动相A为60:40,v/v的乙腈/水、 加10mM甲酸铵和 0.1％甲酸， 流动相B为90:10,v/v的异丙醇/乙腈、 加10mM甲酸铵和0.1％甲酸。 梯度时长为 20min， 流速为0.4mL/min； 采用规格2.1 ×100mm,1.7 μm的反相色谱柱Waters  CSH C18色谱 柱， 进行分离， 色谱柱温度为5 5℃， 进样体积为2 μL； 非靶向脂质组学检测中质谱条件为： 采用配备了电喷雾离子源的Bruker  impact II四 极杆飞行时间质谱， 正离子模式。 碰撞气 体： 氩气。 质谱参数设置如下： 离子源温度 220℃； 喷 雾电压， 4500V； 干燥气8L/min； 雾化器气 1.8Bar； 碰撞能量为7eV， 传输时间为80 μs。 在Auto   MSn模式下进行二级碎片扫描， 扫描质量范围50 ‑1300Da， 扫描 频率为10Hz。 质量精度由甲酸 钠溶液校正。 10.根据权利要求1所述的基于UHPLC ‑QTOF‑MS的喉癌患者血清脂质组学检测方法， 其 特征在于， 差异脂质的鉴定及统计学分析过程中： 利用SIMCA软件进行多变量分析， 采用 SPSS 22.0软件的非参数检验Mann ‑Whitney U分析对样本中的代谢物进行单变量分析。 根 据 4.0分析软件对可能的差异脂质完成定性及注释。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 115266985 A 3