(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210970308.3 (22)申请日 2022.08.12 (71)申请人 卡士乳业 （深圳） 有限公司 地址 518105 广东省深圳市宝安区松岗街 道东方村大田洋工业区东方大道 (72)发明人 俞兰秀　黄彩娟　杨郁荭　 (74)专利代理 机构 广州粤高专利商标代理有限 公司 44102 专利代理师 林宇然 (51)Int.Cl. G01N 30/02(2006.01) G01N 30/06(2006.01) (54)发明名称 一种基于动态高压微射流结合高效液相色 谱技术分析活性乳清蛋白含量的方法 (57)摘要 本发明涉及一种基于动态高压微射流结合 高效液相色谱技术分析活性乳清蛋白含量的方 法， 属于检测分析技术领域； 以高效液相色谱技 术为基础， 结合动态高压微射流技术对样品进行 前处理， 破坏酪蛋白和乳清蛋白之间， 以及蛋白 质和其它成份 之间的非特异性结合， 进而采用高 效液相色谱法进行测定。 即以多孔性填料为固定 相， 依据样品组分对固定相和流动相的分配系数 的差别进行分离， 同时实现几种活性乳清蛋白的 定量分析， 建立一种快速简便、 准确的检测活性 乳清蛋白含量的方法。 权利要求书1页 说明书4页 附图4页 CN 115480002 A 2022.12.16 CN 115480002 A 1.一种基于动态高压微射流结合高效液相色谱技术分析活性乳清蛋白含量的方法， 其 特征在于， 该方法包括以下步骤： (1)准确称取乳样品100.00克， 在4℃条件下经5000g离心 20min， 或7000g离心20min， 或9000g离心20min， 或11000g离心20min脱脂； (2)由步骤(1)得 到的样品取中间清液， 用去离子水稀释2倍， 或4倍， 或6倍； (3)将由步骤(2)得到的样品进行 动态高压微射流处理： 进行20MPa处理一次， 或20MPa处理两 次， 或20MPa处理三次， 或40MPa 处理一次， 或40MPa处理两次， 或40MPa处理三次， 或60MPa处理一次， 或60MPa处理两次， 或 60MPa处理三次； (4)过0.22 μm水系滤膜， 进行高效液相色谱分析， 色谱柱为gel  2000SWXL， 规格为300mm ×7.8nm， 或C18柱， 规格为4.6mm ×250mm， 所述的流动相为0.1mol/LNaNO3溶液 和0.1mol/L  Na3PO4‑Na2SO4缓冲液， 或0.2mol/L  Na3PO4缓冲液， 或0.1％三氟乙酸溶液和 0.1％三氟乙酸 乙腈溶液， 其中， NaNO3的pH为7.0， Na3PO4‑Na2SO4的pH为6.7， Na3PO4的pH为 7.0； 柱温为35℃或25℃， 进样量为10μL， 高效液相色谱检测器为紫外检测器， 检测波长为 214nm， 或220nm， 或230nm， 或254nm， 或280nm； (5)根据 标准曲线获得样品中α ‑乳白蛋白、 β ‑ 乳球蛋白和乳 铁蛋白的含量。 2.根据权利 要求1所述的方法， 其特征在于， 所述的最佳离心脱脂条件为： 样品经7000g 离心20min。 3.根据权利要求1所述的方法， 其特 征在于， 所述的样品稀释倍数最佳为 4倍。 4.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于， 所述的最佳动态高压微射流处理方式为： 40MPa处理两次。 5.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于， 所述的最佳色谱柱为C18柱， 规格为4.6mm ×250mm。 6.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于， 所述的高效液相色谱分析流动相最佳为 0.1％三氟乙酸溶 液和0.1％三氟乙酸乙腈溶 液。 7.根据权利要求1所述方法， 其特征在于， 所述的高效液相色谱分析最佳检测波长为 280nm。 8.根据权利要求1所述方法， 其特 征在于， 最佳柱温为： 25℃。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115480002 A 2一种基于动态 高压微射流结 合高效液相色谱技术分析活性乳 清蛋白含量的方 法 技术领域 [0001]本发明属于检测 分析的技术领域， 更具体地， 涉及一种基于动态高压微射流结合 高效液相色谱技 术分析活性乳清蛋白含量的方法。 背景技术 [0002]牛乳中乳清蛋白含量约占牛乳总蛋白的20％。 乳清蛋白主要包括α ‑乳白蛋白( α ‑ LA)、 β‑乳球蛋白( β ‑LG)和乳铁蛋白(LF)等。 研究发现， 乳清蛋白中的氨基酸比例极佳， 具有 较高的营养价值， 有 “蛋白之王 ”的美称。 α‑LA是乳清蛋白中的主要蛋白质之一。 α ‑LA在牛乳 中占总蛋白含量的2％～3％， 在母乳中占总蛋白含量的20％～25％。 牛奶乳清蛋白中约 50％是β‑LG， β‑LG含有一个疏水核心， 是由8个反平行的β ‑链折叠形成的花萼状结构， 可以 结合许多小分子物质。 单体中的Cys ‑106到Cys ‑119和Cys ‑66到Cys‑160， 这两个二硫键维持 了β‑LG的结构完整性。 牛乳铁蛋白是牛乳及其制品中重要的功能蛋白之一。 我国牛乳和乳 制品的消费正逐年加大。 乳业专家 提出， 应强化牛乳铁蛋白在乳制品、 营养保健品和药品中 的应用。 现有对这几种乳清中的活性蛋白质的定量检测方法主要有酶联免疫法和高效液相 色谱法等。 然而常规的乳样品中， 乳清蛋白与酪 蛋白紧密结合在一起， 在 采用高效液相色谱 法进行检测之前， 需要先沉淀酪蛋白， 分离出乳清蛋白， 才能实现定量分析的目的。 但是沉 淀酪蛋白较低的可控性和重复性严重影响了样品检测的稳定性。 造成了检测成本较高， 试 剂使用量大， 操作复杂， 重现性 不好等一系列问题。 发明内容 [0003]针对上述现有的技术问题， 本发明的目的在于提供一种分析活性乳清蛋白含量的 方法。 本发 明以色谱技术为基础， 结合动态高压微射流技术对样品进 行前处理， 破坏蛋白质 之间以及蛋白质和其它成份之间的非特异性结合， 进而采用高效液相色谱法进行测定， 依 据样品组分对固定相和流动相的分配系数的差别进行分离， 同时实现 几种活性乳清蛋白的 定量分析， 建立一种快速简 便、 准确的检测活性乳清蛋白含量的方法。 为评价原料乳及巴氏 杀菌乳的品质提供 快速稳定检测方法， 并为相关乳制品开发提供 数据支撑 。 [0004]为了实现上述目的， 本发明是通过以下技 术方案予以实现的： [0005]一种基于动 态高压微射流结合高效液相色谱技术分析乳清蛋白含量的方法， 其特 征在于， 该方法包括以下步骤： (1)准确称取乳样品100.00克， 在4℃条件下经5000g离心 20min， 或7000g离心20min， 或9000g离心20min， 或11000g离心20min脱脂； (2)由步骤(1)得 到的样品取中间清液， 用去离子水稀释2倍， 或4倍， 或6倍； (3)将由步骤(2)得到的样品进行 动态高压微射流处理： 进行20MPa处理一次， 或20MPa处理两 次， 或20MPa处理三次， 或40MPa 处理一次， 或40MPa处理两次， 或40MPa处理三次， 或60MPa处理一次， 或60MPa处理两次， 或 60MPa处理三次； (4)过0 .22μm水系滤膜， 进行高效液相色谱分析， 色谱柱为gel   2000SWXL300  mm×7.8nm或C18柱(4.6mm ×250mm)， 所述的流动相为0.1mol/L  NaNO3(pH 说　明　书 1/4 页 3 CN 115480002 A 3