(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 20221089012 2.7 (22)申请日 2022.07.27 (71)申请人 河南省健康元生物医药研究院有限 公司 地址 454003 河南省焦作市马村区金源路8 号 (72)发明人 梁恒宇　幸志伟　李林　郭慧萍　 杨梦园　李雪亮　张敏　韩超　 陈民良　周鹏　张皓　 (74)专利代理 机构 北京慕达星云知识产权代理 事务所 (特殊普通合伙) 11465 专利代理师 田立媛 (51)Int.Cl. C12Q 1/04(2006.01)G01N 21/80(2006.01) G01N 30/02(2006.01) C12R 1/75(2006.01) (54)发明名称 一种基于固体发酵的产黄支顶孢霉高通量 筛选方法 (57)摘要 本发明公开了一种基于固体发酵的产黄支 顶孢霉高通量筛选方法， 属于高通量筛选和工业 微生物菌种选育技术领域， 包 括如下步骤： (1)取 待筛选产黄支顶孢霉单菌落， 制成单菌落混悬 液， 并使用亚精胺进行培养前处理； (2)将处理后 的单菌落混悬液涂布于添加有pH指示剂 的固体 发酵培养基上， 进行培养； (3)培养后根据固体发 酵培养基的颜色变化筛选产黄支顶孢霉； 头孢菌 素C产量与发酵后pH值呈负相关。 本发明方法培 养及筛选过程简便、 快捷， 筛选效率高， 适于推广 应用。 权利要求书2页 说明书9页 附图3页 CN 115232856 A 2022.10.25 CN 115232856 A 1.一种基于固体发酵的产黄支 顶孢霉高通 量筛选方法， 其特 征在于， 包括如下步骤： (1)取待筛选产黄支顶孢霉单菌落， 制成单菌落混悬液， 并使用亚精胺进行培养前处 理； (2)将处理后的单菌落混悬 液涂布于添加有pH指示剂的固体发酵培 养基上， 进行培 养； (3)培养后根据固体发酵培养基的颜色变化筛选产黄支顶孢霉； 头孢菌素C产量与发酵 后pH值呈负相关。 2.根据权利要求1所述的一种基于固体发酵的产黄支顶孢霉高通量筛选方法， 其特征 在于， 步骤(1)中， 所述待筛选产黄支顶孢霉包括经诱变育种获得的突变株， 经遗传改造策略改造后的基 因突变株， 或由于 菌种退化需要 进行复壮的分离单菌株。 3.根据权利要求1所述的一种基于固体发酵的产黄支顶孢霉高通量筛选方法， 其特征 在于， 步骤(1)中， 待筛选产黄支顶孢霉单菌落制成单菌落混悬液后， 使用亚精胺 ‑PBS磷酸盐缓冲液进行 培养前处理； 所述亚精胺‑PBS磷酸盐缓冲液中亚精 胺的浓度为1.0～10.0m mol/L； 所述培养前处理时间为20 ‑30min。 4.根据权利要求1所述的一种基于固体发酵的产黄支顶孢霉高通量筛选方法， 其特征 在于， 步骤(2)中， 所述固体发酵培 养基配方为： 果糖， 20～30g/L； 可溶性淀粉， 15～30g/L； 金枪鱼膏， 15～25g/L； DL ‑甲硫氨酸， 10～ 15g/L； 硫酸铵， 15～25g/L； 聚蛋白胨， 20～30g/L； MgSO4·7H2O， 2～3g/L； FeSO4·7H2O， 1～ 2g/L； 玉米浆， 10～15mL/L； α ‑淀粉酶0.1～0.2g/L； 琼脂糖， 10～15g/L； pH＝7.20 ±0.05。 5.根据权利要求1所述的一种基于固体发酵的产黄支顶孢霉高通量筛选方法， 其特征 在于， 步骤(2)中， 所述pH指示剂包括溴甲酚蓝、 溴甲酚紫、 茜素磺酸钠、 乙氧基黄叱精、 儿茶酚紫、 甲基 红、 溴百里酚蓝或二苯氨基脲； 所述pH指示剂在固体发酵培 养基中的添加浓度为0.1～10m mol/L。 6.根据权利要求1所述的一种基于固体发酵的产黄支顶孢霉高通量筛选方法， 其特征 在于， 步骤(2)中， 所述固体发酵培 养基置于孔板中； 培养条件为25 ‑30℃培养7d。 7.根据权利要求1所述的一种基于固体发酵的产黄支顶孢霉高通量筛选方法， 其特征 在于， 步骤(3)中，权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 115232856 A 2对于头孢菌素C产量发生正突变的潜力高产产黄支顶孢霉而言， 发酵后pH降至5.50 ± 0.30。 8.根据权利要求1所述的一种基于固体发酵的产黄支顶孢霉高通量筛选方法， 其特征 在于， 步骤(3)中， 对于头孢菌素C产量发生正突变的潜力 高产产黄支顶孢霉而言， 固体发酵培养基颜色 发酵前后的变化分别为： 添加溴甲酚蓝， 从深蓝紫色变为浅 土黄色； 添加溴甲酚 紫， 从深紫色变为浅 黄色； 添加茜素磺酸钠， 从土橙红色变为土红色； 添加乙氧基黄叱精， 从黄色变为土红色； 添加儿茶酚 紫， 从青紫色变为黄色； 添加甲基红， 从土红色变为土 黄色； 添加溴百 里酚蓝， 从深蓝色变为黄绿色； 添加二苯氨基脲， 从深紫色变为土 黄色。 9.根据权利要求1所述的一种基于固体发酵的产黄支顶孢霉高通量筛选方法， 其特征 在于， 所述固体发酵培 养基中的固化用成分为 琼脂糖或琼脂； 所述高通 量筛选方法还 包括头孢菌素C含量的测定： 将培养后带有菌体的固体发酵培养基加入无菌缓冲体系打碎， 使用琼脂糖酶进行酶 解， 离心过 滤后进行HPLC检测， 筛 选高产头孢菌素C的菌株。 10.根据权利要求9所述的一种基于 固体发酵的产黄支顶孢霉高通量筛选方法， 其特征 在于， 所述无菌缓冲体系包括水或 缓冲液； 酶解温度为37 ‑42℃， 酶解时间为20 ‑30min。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 115232856 A 3