(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210953182.9 (22)申请日 2022.08.10 (71)申请人 中国海洋大学 地址 266100 山东省青岛市崂山区松岭路 238号 (72)发明人 董平　邢龙　高琪　王静凤　 (74)专利代理 机构 青岛海昊知识产权事务所有 限公司 37201 专利代理师 刘艳青 (51)Int.Cl. G01N 30/02(2006.01) G01N 30/06(2006.01) G01N 30/54(2006.01) G01N 30/74(2006.01) (54)发明名称 同时测定6种维生素A族化合物的高效液相 色谱检测方法 (57)摘要 本发明公开了一种同时测定6种维生素A族 化合物的高效液相色谱检测方法， 通过对6种维 生素A族化合物进行紫外全波长扫描确定了其最 大吸收波长为325  nm、 350 nm、 380 nm、 460 nm， 将其作为检测波长进行分析测定。 本发明中选用 的色谱柱 适用于类胡萝卜素化合物的分离， 对维 生素A族化合物也能实现较好的分离效果， 选用 的甲基叔丁基醚流动相极性小， 对酯类物质和 β‑胡萝卜素的洗脱速度快， 所建立梯度洗脱方 法能够使得6种维生素A族化合物得到有效的分 离， 出峰时间稳定且峰型良好， 易于进行含量的 测定。 本发明能够在15分钟内完成6种不同形式 维生素A类化合物的分离测定， 大大缩短了检测 时间。 权利要求书1页 说明书13页 附图2页 CN 115308329 A 2022.11.08 CN 115308329 A 1.一种同时测定6种维生素A族化合物的高效液相色谱检测方法， 其特征在于， 该检测 方法包括以下步骤： 样品前处 理， 进行皂化和非皂化处 理； 配置标准品溶液， 包括维生素A、 维生素A酸、 全反式视黄醛、 维生素A醋酸酯、 维生素A棕 榈酸酯和β ‑胡萝卜素的标准品； 样品溶液和标准品溶液进行高效液相色谱处理； 高效液相色谱条件为： 色谱柱采用C30， 采用梯度洗脱程序， 流动相为： 0 ‑8 min 90%A （甲醇） 、 1%B （超纯水） 、 9%C （甲基叔丁基醚） ；   8.1‑16 min 35%A （甲醇） 、 6 5%C （甲基叔 丁基醚） ； 制作维生素A、 维生素A酸、 全反式视黄醛、 维生素A醋酸酯、 维生素A棕榈酸酯和β ‑胡萝 卜素的标准品的标准曲线； 基于标准曲线， 对样品中维生素A族化 合物的定量和定性分析。 2.如权利要求1所述的高效液相色谱检测方法， 其特 征在于， 所述 步骤 （1） 具体为： 1） 皂化样品前处理过程为： 样品匀浆， 加入抗坏血酸和氢氧化钾溶液， 将无水乙醇溶液 加入匀浆样品中进 行超声提取， 加入乙酸乙酯萃 取， 将萃取液经无水硫酸钠干燥后， 再减压 蒸发， 氮干， 最后用乙醇、 三氯甲烷 （1： 1， v/v） 混合溶液溶解后， 有机膜过滤后进高效液相色 谱仪进行分析； 2） 非皂化样品前处理过程为： 样品匀浆， 加入抗坏血酸， 将无水乙醇溶液加入匀浆样品 中进行超声提取， 加入石油醚萃 取， 将萃取液用蒸馏水水洗至萃 取液经pH试纸检测呈中性， 经无水硫酸钠干燥后， 将萃取液进行减压蒸发， 氮干， 用乙醇、 三氯甲烷 （1： 1， v/v） 混合溶液 溶解后， 有机膜过 滤后进高效液相色谱仪进行分析。 3.如权利要求1所述的高效液相色谱检测方法， 其特征在于， 所述步骤 （2） 中标准品的 制备： 称取维生素A、 维生素A酸、 全反式视黄醛、 维生素A醋酸酯、 维生素A棕榈酸酯标准品分 别用抗坏血酸乙醇溶液溶解， 得到浓度为1  mg/mL的标准储备液， 避光低温保存； 称取β ‑胡 萝卜素用L 抗坏血酸 三氯甲烷溶解， 得到浓度为1  mg/mL的标准储备 液。 4.如权利要求1所述的高效液相色谱检测方法， 其特征在于， 所述步骤 （3） 中， 所述高效 液相色谱分析条件具体如下： 色谱柱采用YMC ‑β carotene  C30（4.6 mmx250 mm， 3 μm） ， 进样 量为20 μL、 流速为0.8 ‑1.0 mL/min、 检测波长为325  nm、 350 nm、 380 nm、 460 nm。 5.如权利要求1所述的高效液相色谱检测方法， 其特征在于， 所述步骤 （4） 中， 分别准确 吸取1 mg/mL维生素A、 维生素A酸、 全反式视黄醛、 维生素A醋酸酯、 维生素A棕榈酸酯、 β ‑胡 萝卜素标准工作液200  μL， 用抗坏血酸乙醇溶液稀释定容配置成浓度分别 为50 μg/mL、 25   μg/mL、 10  μg/mL、 5 μg/mL、 2.5  μg/mL、 1μg/mL、 0.5  μg/mL的混合标准工作液， 从高浓度到 低浓度依次进高效液相色谱仪进 行分析测定， 以浓度为横坐标， 以对应峰面积为纵坐标， 进 行标准曲线的绘制。 6.如权利要求2所述的高效液相色谱检测方法， 其特征在于， 所述步骤 （1） 中， 超声提取 的具体条件是6 0 ℃超声， 6 00W， 提取3 0 min。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115308329 A 2同时测定6种 维生素A族化合物的高 效液相色谱检测方 法 技术领域 [0001]本发明涉及一种高效液相色谱 ‑二极管阵列检测法同时测定6种维生素A族化合物 的方法， 属于化学检测技 术领域。 背景技术 [0002]维生素A是最早被发现的一种脂溶性的维生素， 结构组成包括一个β ‑紫罗酮环、 一 个由四个头尾相连的类异戊二烯单元组成的侧链以及在碳 ‑15位结合了一个烃基(视黄 醇)、 或者醛基(视黄醛)、 或者羧基(视黄酸)或者酯基(视黄酯)。 维生素A一族 具有视黄 醇生 物活性， 包括两大类物质， 一种 是类视黄醇物质， 指视黄醇、 其代谢产物以及具有相似结构 的合成类似物， 来源于动物性食物。 另一种 是维生素A原类胡萝卜素， 是膳食视黄醇的前体 物质， 来自于植物性食物， 主要包括β ‑胡萝卜素、 α ‑胡萝卜素和β ‑隐黄质， 其中β ‑胡萝卜素 的维生素A活性最高， 维生素A作为人体必须的一种维生素， 对于机体的正常代谢具有重要 意义。 [0003]目前， 关于维生素A族化合物的研究多采用皂化的前处理方法， 仅能实现对单一视 黄醇定量， 液相色谱 ‑串联质谱的检测方法可以实现对不同形式维生素A族化合物的定性， 但是相较于液相色谱的检测方法检测成本高昂， 操作要求严格等特点， 目前 的检测方法具 有一定的局限性。 发明内容 [0004]本发明提供了一种同时测定6种维生素A族化合物的高效液相色谱检测方法， 以弥 补现有技 术的不足。 [0005]为达到上述目的， 本发明所采取的具体技 术方案为： [0006]一种同时测定 6种维生素A族化 合物的高效液相色谱检测方法， 包括以下步骤： [0007](1)样品前处 理， 进行皂化和非皂化处 理； [0008](2)配置标准品溶液， 包括维生素A、 维生素A酸、 全反 式视黄醛、 维生素A醋酸酯、 维 生素A棕榈酸酯和β ‑胡萝卜素的标准品； [0009](3)样品溶液和标准品溶液进行高效液相色谱处理； 高效液相色谱条件为： 色谱柱 采用C30， 梯度洗脱程序为： 0 ‑8min 90％A(甲醇)、 1％B(超纯水)、 9％C(甲基 叔丁基醚)； 8.1‑ 16min35％A(甲醇)、 6 5％C(甲基叔 丁基醚)； [0010](4)制作维生素A、 维生素A酸、 全反 式视黄醛、 维生素A醋酸酯、 维生素A棕榈酸酯和 β‑胡萝卜素的标准品的标准曲线； [0011](5)基于标准曲线， 对样品中维生素A族化 合物的定量和定性分析。 [0012]进一步的， 所述 步骤(1)具体为： [0013]1)皂化样品前处理过程为： 样品匀浆， 加入抗坏血酸和氢氧化钾溶液， 将无水乙醇 溶液加入匀浆样品中进 行超声提取， 加入乙酸乙酯萃 取， 将萃取液经无水硫酸钠干燥后， 再 减压蒸发， 氮干， 最后用乙醇、 三氯甲烷(1： 1， v/v)混合溶液溶解后， 有机膜过滤后进高效液说　明　书 1/13 页 3 CN 115308329 A 3