(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210917024.8 (22)申请日 2022.08.01 (71)申请人 北京振东 光明药物研究院有限公司 地址 100000 北京市海淀区上地创业路18 号1幢2层201室 (72)发明人 李婷　魏锋　李昆　游蓉丽　 杨晓宁　姚静　 (74)专利代理 机构 北京超凡宏宇专利代理事务 所(特殊普通 合伙) 11463 专利代理师 王焕 (51)Int.Cl. G01N 30/02(2006.01) G01N 30/06(2006.01) G01N 30/34(2006.01) G01N 30/72(2006.01)G01N 30/86(2006.01) (54)发明名称 含水蛭、 全 蝎、 僵蚕和/或土鳖虫的制剂的鉴 别方法及其应用 (57)摘要 本发明涉及中药药物分析方法技术领域， 尤 其是涉及一种含水蛭、 全 蝎、 僵蚕和/或土 鳖虫的 制剂的鉴别方法及其应用。 所述鉴别方法， 包括 如下步骤： 采用UPLC ‑QqQ/MS对制剂的供试品溶 液进行检测， 获得MRM色谱图； 液相色谱条件： 色 谱柱为Hss  T3C18色谱柱； 柱温为30 ±5℃； 以甲 酸水溶液为流动相A， 乙腈为流动相B进行梯度洗 脱； 质谱条件： ESI+模式， 采用多反应监测采集方 式。 本发明采用上述方法可对含水蛭、 全蝎、 僵 蚕、 土鳖虫4味动物药中的任一种或多种的制剂 进行定性鉴别， 该方法专属性强、 灵敏度高， 可以 有效提高制剂的质量控制。 权利要求书2页 说明书15页 附图5页 CN 115290782 A 2022.11.04 CN 115290782 A 1.含水蛭、 全蝎、 僵蚕和/或土鳖 虫的制剂的鉴别方法， 其特 征在于， 包括如下步骤： 采用UPLC ‑QqQ/MS对制剂的供 试品溶液进行检测， 获得MRM色谱图； 所述UPLC ‑QqQ/MS的条件 包括： 液相色谱条件： 色谱柱为Hss  T3 C18色谱柱； 柱温为30 ±5℃； 以甲酸水溶液为流动相 A， 乙腈为流动相B进行梯度洗脱； 质谱条件： ESI+模式， 离子源温度为100～150℃， 毛细管电压为2.5～3.5kV， 锥孔电压 为15～30V， 除溶剂温度为400～500℃， 除溶剂气体流速为800～1000L/h， 采用多反应监测 采集方式。 2.根据权利要求1所述的鉴别方法， 其特征在于， 还包括： 将获得的MRM色谱图与特征图 谱进行比对； 所述特征图谱的构建方法包括： (a)采用UPLC ‑QTOF/MS采集水蛭、 全蝎、 僵蚕和土鳖虫各单味药的供试品溶液的总离子 流色谱图； 对所述总离 子流色谱图进行 预处理得到二维的离 子强度图； (b)对步骤(a)UPLC ‑QTOF/MS采集的数据进行主成分分析和正交偏最小方差分析， 筛选 出特征离子； (c)根据步骤(b)得到的特征离子， 在多反应监测模式下进行检测， 获得特征离子的MRM 色谱图， 得到特 征离子对。 3.根据权利要求2所述的鉴别方法， 其特征在于， 步骤(a)中， 所述UPLC ‑QTOF/MS的条件 包括： 液相色谱条件： 色谱柱为Hss  T3 C18色谱柱； 柱温为30 ±5℃； 以甲酸水溶液为流动相 A， 乙腈为流动相B进行梯度洗脱； 质谱条件： ESI+模式， 离子源温度为100～150℃， 毛细管电压为2.5～3.5kV， 锥孔电压 为15～30V， 除溶剂温度为400～500℃， 除溶剂气体流速为800～1000L/h， 采用 MSEcontinuum采集方式， 扫描范围5 0～1500amu； 优选的， 步骤(c)中， 所述检测的条件包括： ESI+模式， 离子源温度为100～150℃， 毛细 管电压为2.5～3.5kV， 锥孔电压为15～30V， 除溶剂温度为400～500℃， 除溶剂气体流速为 800～1000L/h。 4.根据权利要求1或3所述的鉴别方法， 其特征在于， 所述梯度洗脱的程序包括： 0～ 25min， 流动相A的体积分数由97％变至80％； 25～45min， 流动相A的体积分数由80％变至 50％。 5.根据权利要求1或3所述的鉴别方法， 其特征在于， 所述流动相A中， 甲酸的体积分数 为0.05％～0.15％； 和/或， 所述梯度洗脱的流速为0.25～0.3 5mL/min； 和/或， 所述色谱柱的规格为2.1m m×100mm， 1.8 μm。 6.根据权利要求2所述的鉴别方法， 其特征在于， 所述制 剂的供试品溶液为胰蛋白酶酶 解液； 各单味药的供 试品溶液为各单味药的胰蛋白酶 酶解液； 优选的， 所述供试品溶液的制备包括： 以水作为提取溶剂对制剂或各单味药进行提取 处理， 收集液体并蒸干， 用碳 酸氢铵溶 液溶解， 加入 胰蛋白酶溶 液， 于37±1℃酶解10～14h 。 7.根据权利要求2所述的鉴别方法， 其特征在于， 步骤(a)中， 所述预处理包括： 归一化权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 115290782 A 2处理、 峰对齐处 理、 峰提取处 理和去卷积化处 理； 优选的， 所述预处 理的参数设定为： 保留时间范围为1～45mi n， 质谱范围为5 0～2000。 8.根据权利要求1 ‑3或6‑7中任一项所述的鉴别方法， 其特征在于， 所述制剂还包括地 龙； 优选的， 所述制剂包括芪蛭 通络胶囊。 9.根据权利要求8所述的鉴别方法， 其特征在于， 所述芪蛭通络胶囊中， 水蛭、 全蝎、 僵 蚕和土鳖虫的特征离子包括： m/z  593.84、 m/z  449.28、 m/z  265.16、 m/z  251.35、 m/z   295.30、 m/z 301.13、 m/ z 249.41、 m/ z 1105.8、 m/z 599.5、 m/z 904.6； 优选的， 所述芪蛭通络胶囊中， 水蛭、 全蝎、 僵蚕和土鳖虫的特征离子对包括： m/z   593.84→249.45； m/z  593.84→910.71； m/z  449.28→233.39； m/z  449.28→374.54； m/z   265.16→136.11； m/z  265.16→206.27； m/z251.35 →192.30； m/z  251.35→234.30； m/z   295.30→236.33； m/z295.30 →278.06； m/z  301.13→242.34； m/z  301.13→284.22； m/ z249.41→190.27； m/z  249.41→232.42； m/z  1105.8→657.34； m/z1105.8 →835.59； m/z   599.5→355.44； m/z 599.5→468.22； m/z 904.6→263.38； m/z 904.6→479.24。 10.权利要求1 ‑9任一项所述的鉴别方法在芪蛭 通络胶囊的质量控制中的应用。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 115290782 A 3