(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210867792.7 (22)申请日 2022.07.21 (71)申请人 西安交通大 学 地址 710049 陕西省西安市咸宁西路28号 (72)发明人 贺浪冲　贺怀贞　王程　韩省力　 葛帅　卢佳雨　 (74)专利代理 机构 西安通大专利代理有限责任 公司 6120 0 专利代理师 范巍 (51)Int.Cl. B01J 20/286(2006.01) B01J 20/30(2006.01) B01D 15/38(2006.01) G01N 30/02(2006.01) (54)发明名称 基于天然纳米盘SMALP的His-tag键合型细 胞膜色谱柱及其制备方法和应用 (57)摘要 本发明公开了一种基于天然纳米盘SMALP的 His‑tag键合型细胞膜色谱柱及其制备方法和应 用， 属于跨膜蛋白受体固定化工程技术领域。 该 方法首先水解苯乙烯马来酸酐共聚物得到SMA， 将SMA增溶提取单个膜蛋白形成SMALP； 接着制备 乙烯砜键合硅胶， 然后将乙烯砜键合硅胶与 SMALP反应， 膜蛋白上的Hi s‑tag标签可特异性地 与乙烯砜基发生共价键合 反应， 得到SMALP ‑His‑ tag键合型细胞膜固定相； 最后将固定相通过湿 法装柱得到细胞膜色谱柱。 该方法制备的细胞膜 色谱柱生物识别活性准确度高、 蛋白活性位点朝 向统一、 与载体结合牢固， 弥补了现有细胞膜色 谱缺乏对蛋白的结构准确度和种类特异性控制 的缺陷， 提高了其生物识别的准确度、 灵敏度和 稳定性。 权利要求书2页 说明书6页 附图2页 CN 115193422 A 2022.10.18 CN 115193422 A 1.一种基于天然纳米盘SMALP的His ‑tag键合型细胞膜色谱柱的制备方法， 其特征在 于， 包括： 通过水解苯乙烯马来酸 酐共聚物得到S MA， 将SMA加入到膜悬液中增溶提取单个膜 蛋白形成SMALP， 将SMALP与乙烯砜键合硅胶反应， 使膜蛋白上的His ‑tag标签与乙烯砜基共 价键合， 得到SMALP ‑His‑tag键合型细胞膜固定相， 再经湿法装柱， 制得基于天然纳米盘 SMALP的键合型细胞膜色谱柱。 2.根据权利要求1所述的基于天然纳米盘SMALP的His ‑tag键合型细 胞膜色谱柱的制备 方法， 其特 征在于， 包括以下步骤： 1)将苯乙烯马来酸酐共聚物水解成为苯乙烯马来酸共聚物SMA， 将二乙烯基砜键合到 氨基化硅胶上， 制得乙烯砜基硅胶； 2)培养Hi s‑tag融合蛋白高表 达细胞， 当细胞计 数达到107个时， 离心去除培养基获得细 胞， 超声破碎后离心得到细胞膜， 将细胞膜混悬于SMA增溶缓冲液中， 加入SMA， 室温反应后 离心， 得到SMALP溶 液； 3)将SMALP溶液与乙烯砜基硅胶混合， 室温下振荡反应， 得到SMALP ‑His‑tag键合型细 胞膜固定相； 4)将SMALP ‑His‑tag键合型细胞膜固定相采用湿法装柱获得基于天然纳米盘SMALP的 His‑tag键合型细胞膜色谱柱。 3.根据权利要求2所述的基于天然纳米盘SMALP的His ‑tag键合型细 胞膜色谱柱的制备 方法， 其特征在于， 步骤1)中， 苯乙烯马来酸共聚物SMA具体制备方法如下： 在室温下， 按照 1g： 10mL的用量比， 将苯乙烯马来酸酐共聚物粉末与1M的NaOH溶液充分混匀， 得到混合溶 液， 将该混合溶液加热至沸点后继续回流处理2h， 结束后待其冷却， 然后加入浓盐酸， 充分 混合以沉淀出聚合物， 洗涤沉淀， 采用0.6M的NaOH溶液溶解沉淀， 并调节pH值至8.0， 冷冻干 燥得到苯乙烯马来 酸共聚物即SMA粉末。 4.根据权利要求2所述的基于天然纳米盘SMALP的His ‑tag键合型细 胞膜色谱柱的制备 方法， 其特征在于， 步骤1)中， 采用二乙烯砜与氨基的迈克尔加成反应制备乙烯砜基硅胶， 使用三苯基膦作为催化剂。 5.根据权利要求2所述的基于天然纳米盘SMALP的His ‑tag键合型细 胞膜色谱柱的制备 方法， 其特征在于， 步骤2)中， 将离心去除培养基获得的细胞用含蛋白酶抑制剂的低渗缓冲 液混悬后进行超声破碎， 然后通过差速离心分离， 得到细胞膜； 其中， 所述含蛋白酶抑制剂 的低渗缓冲液， 包括： 20mM  PBS， 2mM EDTA和2 μL/mL蛋白酶抑制剂 PMSF， pH值 为7.4。 6.根据权利要求2所述的基于天然纳米盘SMALP的His ‑tag键合型细 胞膜色谱柱的制备 方法， 其特征在于， 所述His ‑tag融合蛋白高表达细胞采用ACE2 ‑His‑tag HEK293高表达细 胞。 7.根据权利要求2所述的基于天然纳米盘SMALP的His ‑tag键合型细 胞膜色谱柱的制备 方法， 其特征在于， 步骤3)中， 将乙烯砜基硅胶与SMALP溶液混合后， 于 室温下振 荡反应12h， 然后5000r离心处理10min， 去除未结合的蛋 白， 再经过重悬处理， 制得SMALP ‑His‑tag键合 型细胞膜固定相。 8.根据权利要求7所述的基于天然纳米盘SMALP的His ‑tag键合型细 胞膜色谱柱的制备 方法， 其特 征在于， 将乙烯砜基硅胶加至SMALP溶 液中， 使其浓度为1.25％(w/v)。 9.采用权利 要求1～8中任意一项所述的制备方法制得的基于天然纳米盘SMALP的His ‑权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 115193422 A 2tag键合型细胞膜色谱柱。 10.权利要求8所述的基于天然纳米盘SMALP的His ‑tag键合型细胞膜色谱柱在筛选药 物活性成分中的应用。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 115193422 A 3