(19)国家知识产权局 (12)发明 专利 (10)授权公告 号 (45)授权公告日 (21)申请 号 202211050672.4 (22)申请日 2022.08.31 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 115112811 A (43)申请公布日 2022.09.27 (73)专利权人 江苏省计量科 学研究院 （江苏省 能源计量数据中心） 地址 210023 江苏省南京市栖霞区文澜路 95号 专利权人 南京诺唯赞生物科技股份有限公 司 (72)发明人 崔宏恩　冯速　韦宏　叶人元　 刘阳　李爽　廖丹华　方帅　 朱茂林　樊晓琳　 (74)专利代理 机构 南京苏创专利代理事务所 (普通合伙) 32273 专利代理师 王晶杰(51)Int.Cl. G01N 30/06(2006.01) G01N 30/02(2006.01) (56)对比文件 CN 103638018 A,2014.0 3.19 高贵 等.应用AQC柱前衍 生荧光检测脑蛋白 水解液中的氨基酸. 《中国生物制品学杂志》 .2003,第16卷(第6期),第3 65页， 第366页右栏， 第367页左栏第一段. 刘兴国 等.17种氨基酸的RSLC分析方法. 《Application Notes C_LC-30》 .2012,第1页至 第2页第一段. 张淑香 等.AQC柱前衍 生高效液相色谱法测 定动物细胞培 养基中氨基酸. 《生命科 学仪器》 .2007,第5卷第23页. 审查员 谷雨 (54)发明名称 基于柱前衍生-超高效液相色谱的蛋白标准 物质测定方法 (57)摘要 本发明涉及一种基于柱前衍生 ‑超高效液相 色谱的蛋白标准物质测定方法， 属于生物医药质 量控制技术领域。 包括如下步骤： 将待测蛋白样 品进行水解， 形成待测游离氨基酸水溶液； 配置 内标工作液和混合标准工作液； 向得到的待测游 离氨基酸水溶液加入内标工作液和混合标准工 作液， 进行衍生化， 将游离氨基酸转化为稳定的 衍生物； 选择流动相和色谱柱； 采用超高效液相 色谱依次对配制的混合标准工作液和衍生物进 行分离检测， 记录超高效液相色谱信号强度； 根 据公式计算蛋白的质量浓度。 对蛋白样品测定结 果之间的误差较小， 且成本上比同位素标记氨基 酸内标价格更为低廉， 因此方法的分析成本更 低。 权利要求书2页 说明书6页 CN 115112811 B 2022.11.29 CN 115112811 B 1.一种基于柱前衍生 ‑超高效液相色谱的蛋白标准物质测定方法， 其特征在于： 包括如 下步骤： 步骤1： 将待测蛋白样品进行水解， 形成待测游离氨基酸水解液： 向待测蛋白样品加入6   mol/L的盐酸， 使用氮吹仪排尽空气后密封， 在110.0 ±0.5℃的烘箱中进行水解96小时， 形 成待测游离氨基酸水解液； 步骤2： 取γ ‑氨基丁酸， 配制内标工作液； 步骤3： 使用17种氨基酸混合溶液国家标准物质， 配制混合标准工作液， 所述混合标准 工作液配置的具体步骤为： 取含有天氡氨酸、 异亮氨酸、 苏氨 酸、 亮氨酸、 丝氨酸、 酪氨酸、 谷 氨酸、 苯丙氨 酸、 甘氨酸、 盐酸赖氨 酸、 丙氨酸、 组氨酸、 胱氨酸、 精氨酸、 缬氨酸、 脯氨酸和甲 硫氨酸的氨基酸混合溶液国家标准物质， 用超纯水稀释至0.5~1.0 mmol/L； 使用氨基酸混 合溶液国家标准物质为溯源标准， 配制一系列混合标准工作液， 浓度范围覆盖待测蛋白含 量； 步骤4： 向步骤1得到的待测游离氨基酸水溶液加入步骤2和步骤3得到的内标工作液和 混合标准工作液， 进行衍 生化， 将游离氨基酸 转化为稳定的衍 生物； 步骤5： 选择适配的流动相和色谱柱： 以pH=5.65的17mmol/L三乙胺+140mmol/L乙酸钠+ 1mg/L乙二胺四乙酸二钠溶液作为流动相A， 以乙腈作为流动相B， 色谱柱选择250*4.6mm  S‑ 5μm的YMC ‑Triart C18， 柱温为30℃， 进样体积为5μL， 检测波长为248  nm， 流速为1.0  mL/ min， 淋洗梯度如下表所示: 时间/min A/% B/% 0 95 5 20 90 10 55 81 19 65 78 22 67 20 80 71 20 80 72 95 5 76 95 5 步骤6： 采用超高效液相色谱依次对配制的混合标准工作液和步骤3得到的衍生物进行 分离检测， 记录超高效液相色谱信号强度， 采用标准曲线法对待测蛋白含量进行测定； 步骤7： 根据如下公式计算蛋白的质量浓度： 其中： 为待测蛋白样品的质量浓度， 为所选择氨基酸的物质的量浓度， 为待测 蛋白样品的相对分子质量， 为待测样品每 个分子中所选择氨基酸的个数。 2.根据权利要求1所述的基于柱前衍生 ‑超高效液相色谱的蛋白标准物质测定方法， 其 特征在于： 所述步骤2中的内标工作液配置的具体步骤为： 称取三氯乙酸和超纯水配制成 0.1g/mL的三氯乙酸溶液， 再称取 γ‑氨基丁酸， 和所述三氯乙酸溶液配制 成200μmol/L的 γ‑氨基丁酸， 即内标工作液。 3.根据权利要求1所述的基于柱前衍生 ‑超高效液相色谱的蛋白标准物质测定方法， 其权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 115112811 B 2特征在于： 所述步骤3中还使用0.1  mol/L 盐酸将天冬酰胺、 谷氨 酰胺、 色氨 酸、 半胱氨 酸配 制成10 mmol/L单标储备液， 置于2℃~8℃保存。 4.根据权利要求1所述的基于柱前衍生 ‑超高效液相色谱的蛋白标准物质测定方法， 其 特征在于： 所述步骤4的具体步骤为： 分别吸取步骤1得到的待测游离氨基酸水溶液和步骤3 得到的混合标准工作液， 至于离心管中， 再吸取步骤2得到的内标工作液于所述离心管中， 进行8000~10000 rmp的离心， 取得到的上清液、 硼酸缓冲液和衍生溶液， 进行水溶， 通过滤 膜后待测， 所述 衍生溶液为6‑氨基喹啉基 ‑N‑琥珀酰‑亚胺基甲酸酯。 5.根据权利要求1所述的基于柱前衍生 ‑超高效液相色谱的蛋白标准物质测定方法， 其 特征在于： 所述 步骤4中水浴温度为5 0~60℃， 滤膜为0.20~0.25 μm。 6.根据权利要求1所述的基于柱前衍生 ‑超高效液相色谱的蛋白标准物质测定方法， 其 特征在于： 所述步骤7中选择天氡氨 酸、 异亮氨 酸、 苏氨酸、 亮氨酸、 丝氨酸、 酪氨 酸、 谷氨酸、 苯丙氨酸、 甘氨酸、 盐酸赖氨酸、 丙氨酸、 组氨酸、 胱氨酸、 精氨酸、 缬氨酸、 脯氨酸和甲硫氨 酸中的任一种以上氨基酸进行检测， 所述待测样品中蛋白的质量浓度为每种氨基酸计算出 的待测样品中 蛋白的质量浓度的平均值。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 115112811 B 3