(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210937262.5 (22)申请日 2022.08.05 (71)申请人 南通大学 地址 226019 江苏省南 通市啬园路9号 (72)发明人 朱清　于陆陆　李俊旭　钱珣佳　 郑铭璁　王丽云　李洁佳　 (74)专利代理 机构 上海申浩 律师事务所 31280 专利代理师 赵青 (51)Int.Cl. G01N 30/02(2006.01) G01N 30/04(2006.01) G01N 30/06(2006.01) G01N 30/86(2006.01) (54)发明名称 定量检测血浆中去甲青藤碱浓度的方法及 检测试剂盒 (57)摘要 本发明提供了定量检测血浆中去甲青藤碱 浓度的方法及检测试剂盒， 使用甲硝唑作为检测 物去甲青藤碱的内标(IS)， NaOH调节血浆pH值 后， 使用乙酸乙酯液液萃取法对 血浆样品进行预 处理， 建立LC ‑MS/MS方法定量检测血浆中去甲青 藤碱浓度， 液相色谱采用AgilentEclipseXDB ‑ C18柱为固定相， 乙腈/乙酸铵缓冲液为流动相， 75/25(V/V)等度洗脱， 质谱采用电喷雾离子源 (ESI)， 使用多离子反应监测(MRM)对去甲青藤碱 进行定量。 去甲青藤碱的最低定量限可达3ng/ mL。 本发明方法对样品检测的专一性强， 灵敏度 高， 操作简便， 各项方法学考证指标均能达到美 国FDA的相关技 术要求。 权利要求书1页 说明书8页 附图2页 CN 115308327 A 2022.11.08 CN 115308327 A 1.一种定量检测血浆中去甲青藤碱浓度的方法， 其特征在于， 采用高效液相色谱 ‑串联 质谱进行检测， 包括以下步骤： 使用甲硝唑作为检测物去甲青藤碱的内标， 使用乙酸乙酯液 液萃取法对血浆样品进行 预处理后， 建立 LC‑MS/MS方法定量检测血浆中去甲青藤碱浓度， 其中， 液相色谱采用4.6 ×12.5mm、 5 μmAgilent  Eclipse XDB‑C18柱偶联4.6 ×150mm、 5 μmAngilent  Eclipse XDB‑C18柱为固定相， 乙腈/乙酸铵缓冲 液为流动相， 以体积比75/25 进行等梯度洗脱； 质谱采用正离子电喷雾电离源模式， 使用多离子反应监测对去甲青藤碱进行定量， 离 子选择通道Q1、 Q3， 去甲青藤碱[M+H]+m/z 316/239。 2.根据权利要求1所述的定量检测血浆中去甲青藤碱浓度的方法， 其特 征在于： 其中， 使用乙酸乙酯液液萃取法对血浆样品进行预处理的方法如下： 向体积为v的血样 样本中加入300ng/mL、 体积为1\10v的内标工作液， 立即涡旋30s； 然后加入体积为1\10v的 1M NaOH溶液， 涡旋1min； 接着将10000v乙酸乙酯分两次加入， 分别涡旋8min， 10000转/分离 心10分钟， 合并上清， 3 0℃水浴下氮吹至吹干， 1.1v  75％乙腈复溶， 进行LC ‑MS/MS分析。 3.根据权利要求1所述的定量检测血浆中去甲青藤碱浓度的方法， 其特 征在于： 其中， 内标甲硝唑溶液的配置方法如下： 用色谱级 甲醇配制成1mg/mL浓度的甲硝唑溶 液，‑20℃保存； 使用时用甲醇稀释成浓度为3 00ng/mL的工作液， 4℃保存待用。 4.根据权利要求1所述的定量检测血浆中去甲青藤碱浓度的方法， 其特 征在于： 其中， 进行色谱分析 时， 流动相A为含10mM的乙酸铵以及0.35％乙酸的水溶液， 流动相 B 为乙腈； 流动相体积比例： A:B＝25:75； 洗脱时， 流速： 0.3mL/min， 柱温： 30℃， 进样量： 2μL， 典型保留时间： 去甲青藤碱: 4.5min； 内标:4.8mi n。 5.根据权利要求1所述的定量检测血浆中去甲青藤碱浓度的方法， 其特 征在于： 其中， 进行质谱分析时， 在电喷雾电离、 正离子解离模式下， 采用多离子反应监测的质 谱扫描模式； 气帘气压力， 40psi； 雾化气压力， 50psi； 辅助加热气压力， 50psi； 喷雾电压， 4000V； 温度， 3 50℃； 气体均为 N2； 去甲青藤碱[M+H]+m/z 316/239， 去簇电压160V， 碰撞电压27V， 出场电压12V； 内标甲硝 唑[M+H]+m/z 172/128， 去簇电压103V， 碰撞电压19V， 出场电压9V； 离子通道范围均为 ± 1.0amu。 6.根据权利要求1所述的定量检测血浆中去甲青藤碱浓度的方法， 其特 征在于： 其中， 去甲青藤碱的定量范围为3 ‑1000ng/mL。 7.一种定量检测血浆中去甲青藤碱浓度的试剂 盒， 其特征在于， 包括洗脱液、 对照品母 液、 质控液、 稀释液。 8.根据权利要求7 所述的检测试剂盒， 其特 征在于： 其中， 所述洗脱液包括洗脱液A和洗脱液B， 分别作为高效液相色谱的流动相A和流动相 B， 流动相A为含10mM的乙酸铵以及0.3 5％乙酸的水 溶液， 流动相B为乙腈； 所述对照品母液为用色谱级 甲醇精密配制的去 甲青藤碱储备液， 浓度为1mg/mL， 用时 用甲醇稀释成不同浓度的去甲青藤碱标准工作液； 所述质控液为浓度为3， 6， 6 0， 800ng/mL的去甲青藤碱标准工作液； 所述稀释液为色谱级甲醇。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115308327 A 2定量检测血浆中去甲青藤碱浓度的方 法及检测试剂盒 技术领域 [0001]本发明属于医药检测技术领域， 具体涉及血浆中去甲青藤碱 的液质联用(高效液 相色谱串联质谱技 术)定量检测方法的建立及方法验证。 背景技术 [0002]中药青风藤为防己科植物青藤Sinomenium  acutum(Thunb.)Rehd.et  Wils.及毛 青藤S.acutum(Thunb.)Rehd.et  Wils.var.cinereum  Rehd.et Wils.的干燥根茎， 最初记 载于 《本草纲目》 ： “治风湿流注， 历节鹤膝， 麻痹瘙痒， 损伤疮肿。 入药酒中用 ”。 中医将青风 藤用于风湿性疾病已有 上千年历史。 青风藤的主要活性化学成分是青藤碱， 具有免疫抑制、 抗炎和镇痛等药理作用。 对青藤碱进 行体内代谢研究， 发现一种与青藤碱中药同源， 且具有 生物活性的主要代谢物——去甲青藤碱。 去甲青藤 碱分子式为C18H21NO4， 分子量为315， 化 学 结构式为： [0003] [0004]本实验室在前人基础上改良化学合成了去甲青藤碱单体， 经实验证实此化合物纯 度＞99％， 在术后痛和神经病理性疼痛动物模型中都有良好的镇痛作用， 证实去甲青藤碱 将是一个非常有前 景的吗啡烷类镇痛药物。 [0005]目前， 去甲青藤碱还处于临床前期研究阶段， 缺乏其药物代谢动力学研究， 而建立 生物样本中去甲青藤碱的定量检测方法是其药物代谢动力学研究前提。 而目前并没有关于 去甲青藤碱的定量方法， 因此急 需建立可靠、 灵敏的液相色谱 ‑串联质谱法(LC ‑MS/MS)测定 血浆中去甲青藤碱的浓度的方法， 为去甲青藤碱的药物 代谢动力学的研究提供技 术支持。 发明内容 [0006]本发明是为解决上述问题而进行的， 目的在于建立高效液相色谱串联质谱技术检 测大鼠血浆中去甲青藤碱的浓度， 为去甲青藤碱的药物 代谢动力学的研究提供基础。 [0007]本发明的第一方面， 提供了一种定量检测血浆中去甲青藤碱浓度的方法， 采用超 高效液相色谱 ‑串联质谱进 行检测， 包括以下步骤： 使用甲硝唑作为检测物去甲青藤碱的内 标， 使用乙酸乙酯液液萃取法对血浆样 品进行预处理后， 建立LC ‑MS/MS方法定量检测血浆 中去甲青藤碱浓度。 [0008]其中， 液相色谱采用4.6 ×12.5mm、 5μmAgilent  Eclipse XDB‑C18柱偶联4.6 × 150mm、 5 μmAngilent  Eclipse XDB‑C18柱为固定相， 乙腈/乙酸铵缓冲 液为流动相， 以体积 比75/25进 行等梯度洗脱； 质谱采用正离子电喷雾电离源模式， 使用多离子 反应监测对去甲说　明　书 1/8 页 3 CN 115308327 A 3