(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210876175.3 (22)申请日 2022.07.25 (71)申请人 仲恺农业工程学院 地址 510225 广东省广州市海珠区仲恺路 501号 (72)发明人 阿丹　郭钦梅　邹梦遥　卢桂宁　 王玉　陈雪晴　李雅莹　彭铭鑫　 (74)专利代理 机构 佛山知正知识产权代理事务 所(特殊普通 合伙) 44483 专利代理师 王兴 (51)Int.Cl. G01N 33/18(2006.01) G01N 21/78(2006.01) G01N 30/02(2006.01) G01N 30/86(2006.01)G01N 21/25(2006.01) G01N 1/10(2006.01) G01N 1/28(2006.01) (54)发明名称 植物芳香有机酸对多环芳烃的共代谢降解 及分子响应 机制 (57)摘要 本发明公开了植物芳香有机酸对多环芳烃 的共代谢降解及分子响应机制。 本发 明中研究发 现AOAs可以为植物根际微生物提供易利用碳源， 并提高PA Hs相关降解菌(如嗜甲基菌和硝基黄杆 菌)的丰度， 从而促进PAHs的生物降解， 特别是一 元酸PCA组中这种现象最为明显， 但二元酚酸CA 组可以强化植物生长活性从而增强植物对PAHs 的吸附和吸收能力， 进而 促进PAHs的整体去除效 果。 由此可见， 利用AOAs促进PAHs等芳香族有机 污染物的生物降解， 既对目标污染物具有高度针 对性， 又不产生二次污染， 使得本发明具备高度 针对性的特点， 同时不会 对环境造成二次污染。 权利要求书2页 说明书8页 附图4页 CN 115267110 A 2022.11.01 CN 115267110 A 1.植物芳香有机酸对多环芳烃的共代谢降解及分子响应机制， 包括以下步骤， 其特征 在于： S1： 实验设计： 实验所采用的芦苇幼苗购置于当地市场， 选取大小、 鲜重、 根长相似的芦 苇作为实验 对象； S2： 样品采集与预处理： 实验装置开始运行后在十天内每天连续采集不同处理组水样 (n＝10)； 每 次采集5mL水样用作COD、 NH4 ‑N、 PAHs浓度实验分析， 采样后立刻添加等量灭菌 的Hoagland营养液作为补充； S3： 分析方法： 1)： 化学需氧量： COD使用水质分析仪(YCNPN ‑4H， JINZHUANG， 上海)测定分析， 水质分析 仪需要根据实际水样COD范围配置量 程合适的COD试剂一和试剂三； 其配置方法如下： a： 试剂一： 在200mL烧杯中加入90mL蒸馏水， 再不断搅拌下沿杯壁加入10mL浓硫酸(实 验分析纯)， 再将COD试剂一粉 包倒入溶解， 冷却后装 入试剂瓶中备用； b： 试剂三： 取整包COD试剂三置于500mL细口棕色瓶中， 加入400mL浓硫酸(实验分析 纯)， 放置 于暗处溶解， 备用； 水样的测定分析： 将水样中的COD浓度稀释10倍后， 取2ml于试管中并依次加入0.5mL试 剂一和2mL试剂三， 然后上机检测， 分析测定结果换算回稀释前浓度即为水样中COD的浓度； 2)： 氨氮： 水体中的NH4 ‑N亦是使用水质分析仪进行测定分析； 根据水样NH4 ‑N的范围， 取0.5mL水样并补加4.5mL蒸馏水于试管中， 依次加入0.1mLNH4 ‑N试剂一和0.15mLNH4 ‑N试 剂二， 加盖摇匀后 静置10分钟待其显色， 然后上机检测， 上机测 定结果即为水样中NH4 ‑N的 浓度； 3)： 多环芳烃： 采用高效液相色谱法对水样中的PAHs浓度进行测定(HPLC； 1260Infinity Ⅱ， 安捷伦， 美国)； S4： 微生物群落分析方法： 采集不同处理组的根系样品共计15个， 用Power  SoilDNA  Isolation Kit试剂盒提取 水样中的DNA， 用Nan o Drop分光 光度计检测DNA的浓度和纯度； S5： 数值计算： 实验中所使用的污染物去除速率常数(k， /d)和去除负荷(RL， mg/d)的计 算公式如下： 和 式中， Ct为t时间水样中污染物的浓度(mg/ L)， V为水样的体积(L)； S6： 数据处理与分析： 实验结束后的数据结果采用EXCEL软件进行处理分析， 对各项指 标数据的平均值、 标准误差、 污染物去除速率常数等进 行计算， 利用SPSS软件对数据间的差 异性使用单因素 方差分析的方法。 2.根据权利要求1所述的植物芳香有机酸对多环芳烃的共代谢降解及分子响应机制， 其特征在于： 实验开始前先用自来水将芦苇幼苗根系 上附着的泥土清洗干净， 再使用超纯 水冲洗两遍， 将芦苇幼苗转移至装有300mL  Hoagland营养液的三角锥形瓶中， 其中包含 1mg/L多环芳烃的典型代表物菲和50mg/L  AOAs， 五组实验组置于人工生化培养箱培养(气 温25±1℃、 湿度80％、 光强8000Lx、 光照12h/d)， 三角锥形瓶瓶身部分使用锡纸进行避光处 理； 每组设置三个平行， AOAs使用磁力加热搅拌器(尚仪SUNNE  SNMS‑H)加热溶解于营养液 中。权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 115267110 A 23.根据权利要求1所述的植物芳香有机酸对多环芳烃的共代谢降解及分子响应机制， 其特征在于： 为了样品更好地反应水体中的真实情况， 采样前需要使用涡旋振荡器混匀水 样， 其中1.5mL用于PAHs浓度分析的水样需经0.22 μm的针筒式滤膜过滤器过滤后， 用甲醇溶 剂将滤膜上的物质洗脱出来并冷冻保存等待上机分析。 4.根据权利要求1所述的植物芳香有机酸对多环芳烃的共代谢降解及分子响应机制， 其特征在于： 色谱分析条件： 选用XTERRA  MS C18色谱柱(4.6 ×250mm， 5 μm)； 进样量15 μL； 流 速1mL/min； DAD检测波长254nm； 柱温40℃； 标准曲线： 取7瓶进样小瓶， 依次加入0、 0.10、 0.20、 0.25、 0.50、 0.75、 1.0mL的1mg/L菲液， 用甲醇稀释至1m， 振荡摇匀， 以甲醇为参比溶 液， 上机测定菲的峰面积， 以峰面积为纵坐标， 相应菲含量 为横坐标绘制出 标曲曲线。 5.根据权利要求1所述的植物芳香有机酸对多环芳烃的共代谢降解及分子响应机制， 其特征在于： 用引物341F和806R扩增细菌16SrRNA序列的V3 ‑V4区， PCR反应体系为50μL， 2xPremix  Taq 25 μL， 341F/806R引物各1μL， DNA  3 μL， Nuclease ‑free water 20 μL， 反应条 件为： 98℃预变性1min， 98℃变性10s， 50℃退火30s， 72℃延伸30s， 共30个循环， 再在72℃下 延伸5min， 最后保存在4℃条件下， 最后使用I lluminaHiseq 2500平台进行测序。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 115267110 A 3