(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202211034803.X (22)申请日 2022.08.26 (71)申请人 益诺思生物技 术南通有限公司 地址 226133 江苏省南 通市海门区临江镇 洞庭湖路10 0号A18楼 (72)发明人 季金风　缪峰　王勇　孙璐瑶　 (74)专利代理 机构 上海弼兴律师事务所 31283 专利代理师 张云燕　刘奉丽 (51)Int.Cl. G01N 30/02(2006.01) G01N 30/06(2006.01) G01N 30/30(2006.01) G01N 30/32(2006.01) G01N 30/34(2006.01) G01N 30/72(2006.01) (54)发明名称 眼内容物中那他霉素的检测方法 (57)摘要 本发明公开了一种眼内容物中那他霉素的 检测方法。 该检测方法包括下述步骤： 采用液相 色谱‑质谱联用法检测眼内容物待测液， 即可； 眼 内容物待测液含有内标物标记的那他霉素； 液相 色谱‑质谱联用法中的液相色谱采用的流动相包 括流动相A与流动相B， 流动相A与流动相B的体积 比为(5～90)： (10～95)； 流动相A为有机酸水溶 液， 有机酸占流动相A总体积的0.002％～ 0.1％； 流动相B为有机酸与乙腈的混合液， 有机酸占流 动相B总体积的0.002％～0.1％； 所述有机酸为 甲酸或乙酸。 该检测方法检测限低、 准确度高、 操 作简便。 权利要求书3页 说明书15页 附图10页 CN 115452977 A 2022.12.09 CN 115452977 A 1.一种眼内容物中那他霉素的检测方法， 其特征在于， 其包括下述步骤： 采用液相色 谱‑质谱联用法检测眼内容物待测液， 即可； 所述眼内容物待测液含有内标物标记的那他霉素； 所述液相色谱 ‑质谱联用法中的液相色谱采用的流动相包括流动相A与流动相B， 所述 流动相A与所述 流动相B的体积比为(5～ 90)： (10～ 95)； 所述流动相A为有机酸水溶液， 有机酸占所述流动相A总体积的0.002％～0.1％； 所述 流动相B为有机酸与乙腈的混合液， 有机酸占所述流动相B总体积的0.002％～0.1％； 所述 有机酸为甲酸或乙酸。 2.如权利要求1所述的眼内容物中那他霉素的检测方法， 其特 征在于， 所述流动相A与所述 流动相B的体积比为10： 90或80： 20； 优选地， 所述 流动相A与所述 流动相B的体积比随时间的变化如下： 时间(min) 流动相A(％) 流动相B(％) 0～0.20 80 20 1.50 10 90 2.01 80 20 2.01‑2.5 80 20 ； 和/或， 所述液相色谱 ‑质谱联用法中， 所述有机酸占所述 流动相A的总体积的0.1％； 和/或， 所述液相色谱 ‑质谱联用法中， 所述有机酸占所述 流动相B的总体积的0.1％； 和/或， 所述眼内容物含有房水、 晶状体和玻璃体中的一种或多种， 例如所述眼内容物 含有房水、 晶状 体或玻璃体； 和/或， 所述眼内容物待测液的制备 方法包括以下步骤： ①取空白眼内容物基质剪碎， 加入匀浆液， 研磨， 匀浆， 得到所述空白眼内容物基质的 匀浆液； ②将所述空白眼内容物基质的匀浆液与内标物 涡旋混合、 离心； ③取②中离心后的上清液涡旋， 即得 所述眼内容物待测液。 3.如权利要求2所述的眼内容物中那他霉素的检测方法， 其特 征在于， 步骤①中， 所述空白眼内容物基质为动物体的空白眼内容物基质， 优选地为新西兰大 白兔的空 白眼内容物基质， 例如新西兰大白兔的空 白房水基质、 新西兰大白兔的空 白晶状 体基质或新西兰大白兔的空白玻璃体 基质； 和/或， 步骤 ①中， 所述匀浆的匀浆液包括甲醇和水； 优选地， 所述甲醇占所述匀浆液的 体积比为1： (1 ‑10)， 优选地 为1： 1； 和/或， 步骤 ①中， 所述空白眼内容物基质与所述匀浆液的体积比为1:(8～20)， 例 如1: 10； 和/或， 步骤 ①中， 所述匀浆在匀浆仪上进行； 和/或， 步骤 ①中， 所述匀浆的速度为6m/sec； 和/或， 步骤 ①中， 所述匀浆的时间为3 0s； 和/或， 步骤 ①中， 所述匀浆的次数至少为2次， 例如2次。 4.如权利要求2所述的眼内容物中那他霉素的检测方法； 其特征在于， 步骤 ②中， 所述权　利　要　求　书 1/3 页 2 CN 115452977 A 2内标物为甲苯磺丁脲； 和/或， 步骤 ②中所述离心的温度为 4℃； 和/或， 步骤 ②中所述离心的离心力为 4700×g； 和/或， 步骤 ②中所述离心的时间为10mi n。 5.如权利要求1所述的眼内容物中那他霉素的检测方法， 其特 征在于， 所述液相色谱 ‑质谱联用法中， 液相色谱的色谱柱固定相型号为十八烷基键合硅胶， 优 选地为YMC‑Triart C18； 和/或， 所述液相色谱 ‑质谱联用法中， 所述液相色谱的色谱柱的规格为50mm ×2.1mm, 1.9 μm； 和/或， 所述液相色谱 ‑质谱联用法中， 液相色谱的柱温为3 0～50℃， 优选为 40℃； 和/或， 所述液相色谱 ‑质谱联用法中液相色谱的进样量 为1～20 μL， 优选为5 μL； 和/或， 所述 流动相的流速为0.4～0.6mL/mi n， 优选地 为0.5mL/mi n。 6.如权利要求1所述的眼内容物中那他霉素的检测方法， 其特 征在于， 所述液相色谱 ‑质谱联用法的设备为型号 为SCIEX/Triple  Quad 4500的液质联用仪； 和/或， 所述液相色谱 ‑质谱联用法中， 质谱的离 子源为电喷雾电离 ESI； 和/或， 所述液相色谱 ‑质谱联用法中， 质谱的离 子化模式为 正离子化模式； 和/或， 所述液相色谱 ‑质谱联用法中， 质谱 采用多反应 检测模式； 优选地， 所述多反应监测模式中， 所述那他霉素的母离子和子离子的质荷比分别为 666.3和503.3； 当所述内标物为甲苯磺丁脲时， 所述甲苯磺丁脲中的母离子和子离子的质荷比分别为 271.1和154.8； 和/或， 所述液相色谱色谱 ‑质谱联用法中， 质谱的扫描间隔时间为80m s。 7.如权利要求1所述的眼内容物中那他霉素的检测方法， 其特征在于， 进行所述检测 前， 还包括建立标准曲线； 优选地， 所述建立标准曲线包括以下步骤： a.配制那他霉素的标准品工作液和内标工作液； b.将a中所述的标准品工作液与空白眼内容物基质混合， 即得 标准样品溶 液； 所述空白眼内容物基质为房水、 晶状体和玻璃体 中的一种或多种， 例如房水、 晶状体或 玻璃体； c.向b中所述的标准样品溶液中加入a中所述的内标工作液涡旋混合、 离心， 取上清液， 涡旋混合， 即得 标准品待测液； d.采用S2中所述检测的方法分析c中所述标准品待测液， 测得那他霉素与所述内标工 作液中内标物的峰面积比； e.根据所述标准样品溶液的那他霉素与所述内标工作液中内标物的峰面积比和所述 标准品工作液的浓度拟合， 得到回归方程， 并绘制所述标准曲线， 即可。 8.如权利要求7所述的眼内容物中那他霉素的检测方法， 其特征在于， 步骤a中， 所述标 准品工作液的配制包括以下步骤： 将所述那他霉素与稀释液混合， 得到标准品储 备液； 再将 所述标准品储备 液与稀释液混合， 即可； 和/或， 所述内标工作液通过将甲苯磺丁脲与内标稀释液混合制得；权　利　要　求　书 2/3 页 3 CN 115452977 A 3