(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210997010.1 (22)申请日 2022.08.19 (71)申请人 珠海市丽珠单抗 生物技术有限公司 地址 519000 广东省珠海市金湾区创业北 路38号单抗大楼 (72)发明人 邓巧春　邓钦培　杨嘉明　谢佳倩　 容宜欣　关欣　路勇　 (74)专利代理 机构 北京华进京联知识产权代理 有限公司 1 1606 专利代理师 董娟 (51)Int.Cl. G01N 30/02(2006.01) G01N 30/06(2006.01) G01N 30/72(2006.01) G01N 33/68(2006.01) (54)发明名称 糖蛋白二硫键的鉴定方法 (57)摘要 本发明涉及一种糖蛋白中二硫键的鉴定方 法。 本发明方法包括TCEP部分还原后嗜热菌蛋白 酶切法， 所述TCEP部分还原后嗜热菌蛋白酶切法 包括以下步骤： (S1)取待测糖蛋白样品， 进行变 性处理； (S2)用三(2 ‑羰基乙基)磷盐酸盐溶液还 原后， 加入 N‑乙基马来酰亚胺反应， 脱盐； (S3)加 入去糖基化酶， 脱盐后测定蛋白浓度； (S4)加入 嗜热菌蛋白酶； (S5)进行UPLC ‑MS分析。 本发明方 法提供了一种准确、 简单、 高效地鉴定蛋白质二 硫键位点的方法。 权利要求书2页 说明书13页 附图4页 CN 115356414 A 2022.11.18 CN 115356414 A 1.一种糖蛋白中二硫键的鉴定方法， 其特征在于， 其包括TCEP部分还原后嗜热菌蛋白 酶切法， 所述TC EP部分还原后嗜热菌蛋白酶切法包括以下步骤： (S1)取待测糖蛋白样品， 进行变性处 理； (S2)用三(2 ‑羰基乙基)磷盐酸盐溶 液还原后， 加入N ‑乙基马来 酰亚胺溶液反应， 脱盐； (S3)加入去糖 基化酶， 脱盐后测定蛋白浓度； (S4)加入嗜热菌蛋白酶； (S5)进行UPLC ‑MS分析。 2.根据权利要求1所述的鉴定方法， 其特征在于， 所述糖蛋白为人绒促性腺素； 和/或， 步骤(S1)所述变性处理所用试剂包括盐酸胍溶液， 所述盐酸胍 溶液的浓度为1 ‑10mol/L， 所 述盐酸胍溶 液的pH为(3 ±0.5)。 3.根据权利要求1所述的鉴定方法， 其特征在于， 步骤(S2)中， 所述三(2 ‑羰基乙基)磷 盐酸盐溶液的浓度为30 ‑50mM， 所述三(2 ‑羰基乙基)磷盐酸盐溶液还原的反应条件包括： 30‑60℃反应10 ‑30min。 4.根据权利要求1所述的鉴定方法， 其特征在于， 所述步骤(S3)中， 所述去糖基化酶为 Deglycosylation  MixⅡ； 和/或， 步骤(S4)中， 所述嗜热菌蛋白酶进行酶切的条件包括： 60 ‑ 70℃环境下酶切15 ‑20小时。 5.根据权利要求1 ‑4任一项所述的鉴定方法， 其特征在于， 步骤(S5)中， UPLC的流动相 为： 有机相为0.05 ‑0.2wt％甲酸的水溶液； 有机相为0.05 ‑0.2wt％甲酸的乙腈溶液； UPLC的 洗脱梯度条件为： 0‑60min： 有机相的体积百分比由1 ‑5％上升到35～40％； 60‑63min： 有机相的体积百分比由3 5～40％上升 到98～10 0％； 63‑65min： 有机相的体积百分比为98～10 0％； 65‑68min： 有机相的体积百分比由98～10 0％降低至1 ‑5％； 68‑72min： 有机相的体积百分比为1 ‑5％。 6.一种糖蛋白中二硫键的鉴定方法， 其特征在于， 其包括采用TCEP部分还原后嗜热菌 蛋白酶切法与差异烷基化法； 其中， 所述TCEP 部分还原后嗜热菌蛋白酶切法如权利要求1 ‑5 任一项所述； 所述差异烷基化法包括以下步骤： (1)样品制备： 取待测糖蛋白样品进行变性处 理； (2)用三(2 ‑羰基乙基)磷盐酸盐溶 液进行还原后， 再与N ‑乙基马来 酰亚胺溶液反应； (3)脱盐、 变性， 再酶切除蛋白上的糖修饰， 醇沉产物； (4)盐酸胍溶解沉淀， 用二硫代苏糖醇溶液还原后与碘乙酰胺溶液反应， 再进行UPLC ‑ MS分析。 7.根据权利要求6所述的鉴定方法， 其特征在于， 步骤(1)中， 所述变性处理所用试剂包 括盐酸胍溶液， 所述盐酸胍溶液的pH为(3 ±0.5)； 进一步地， 所述盐酸胍溶液的浓度为1 ‑ 10mol/L。 8.根据权利要求6所述的鉴定方法， 其特征在于， 步骤(2)所述三(2 ‑羰基乙基)磷盐酸 盐溶液的浓度为0.01 ‑1mol/L； 所述待测糖蛋白样品与三(2 ‑羰基乙基)磷盐酸盐的用量比 为0.2mg： (0.001 ‑0.005)mmol； 和/或， 步骤(2)所述N ‑乙基马来酰亚胺溶液的浓度为0.2 ‑ 0.3mol/L， 所述待测糖蛋白样品与所述N ‑乙基马来酰亚胺的用量比为0.2mg： (0.001 ‑0.01)权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 115356414 A 2mmol。 9.根据权利要求6所述的鉴定方法， 其特征在于， 步骤(4)所述二硫代苏糖醇还原的条 件包括： 30 ‑60℃还原30 ‑60min； 所述二硫代苏糖醇溶液的浓度为0.5 ‑3mol/L， 所述待测糖 蛋白样品与所述 二硫代苏糖醇的用量比为： 0.2mg： (0.0 02‑0.006)mmol； 和/或， 步骤(4)所述碘乙酰胺溶液的浓度为1mol/L， 所述糖蛋白样品与碘乙酰胺的用 量比为： 0.2mg： (0.0 05‑0.02)mmol。 10.根据权利要求6 ‑9任一项所述的鉴定方法， 其特征在于， 步骤(4)所述UPLC ‑MS分析 中， UPLC的流动相为： 有机相为0.05 ‑0.2％甲酸的水溶液； 有机相为0.05 ‑0.2％甲酸的乙腈 溶液； UPLC的洗脱梯度为： 0min： 有机相的体积百分比为2 ‑4％； 0‑26min： 有机相的体积百分比由2 ‑4％提高到8 ‑12％； 26‑30min： 有机相的体积百分比由8 ‑12％提高到18 ‑22％； 30‑60min： 有机相的体积百分比由18 ‑22％提高到28 ‑31％； 60‑70min： 有机相的体积百分比由28 ‑31％提高到 31.5‑34％； 70‑72min： 有机相的体积百分比由31.5 ‑34％提高到98 ‑100％； 72‑75min： 有机相的体积百分比为98 ‑100％； 75‑77min： 有机相的体积百分比由98 ‑100％降低到1 ‑5％； 77‑80min： 有机相的体积百分比为1 ‑5％。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 115356414 A 3