(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210926426.4 (22)申请日 2022.08.03 (71)申请人 瑞安市人民医院 （瑞安市人民医院 医疗服务集团 瑞安市妇幼保健院 瑞安市红十 字医院） 地址 325200 浙江省温州市瑞安市瑞 枫大 道168号 申请人 延边大学 (72)发明人 蒋世翠　李佳芮　郭建鹏　索金玉　 李东浩　张驰　 (74)专利代理 机构 长春市东师专利事务所 22202 专利代理师 张铁生　刘莹 (51)Int.Cl. G01N 33/68(2006.01)G01N 30/72(2006.01) G01N 30/02(2006.01) (54)发明名称 结合MyD88的抗炎活性 成分组合物及筛选方 法 (57)摘要 本发明公开了结合MyD88的抗炎活性成分组 合物， 由汉黄芩素、 黄芩苷、 汉黄芩苷组成的； 筛 选结合MyD88的抗炎活性成分组合物的方法， 它 包括： 配置混标溶液； 将混标溶液用多室电泳筛 选技术， 通过LC ‑MS/MS MRM模式进行检测， 筛选 出3种与靶蛋白MyD88蛋白结合的成分； 定性、 定 量分析， 确定黄芩苷、 汉黄芩苷和汉黄芩素与靶 蛋白MyD88结合的摩尔比例； 优点在于： 具有体外 筛选、 操作简便快捷、 靶向性筛选、 不影 响靶蛋白 的结构和活性、 提高分离效率等优点； 依照比例 协同给药后发现可以显著提升高糖诱导的HK ‑2 细胞的存活率； 可以显著改善高糖诱导的H K‑2细 胞凋亡情况； 可通过抑制信号通路发挥治疗糖尿 病肾病的作用。 权利要求书1页 说明书16页 附图4页 CN 115267205 A 2022.11.01 CN 115267205 A 1.结合MyD 88的抗炎活性成分组合物， 它是由汉黄 芩素、 黄芩苷、 汉黄 芩苷组成的。 2.根据权利要求1所述的结合MyD88的抗炎活性成分组合物， 其特征在于： 所述的汉黄 芩素、 黄芩苷、 汉黄 芩苷摩尔比例为 4:2:1。 3.筛选结合MyD 88的抗炎活性成分组合物的方法， 它包括： 1） 将千金文武汤9种入血成分黄芩苷、 千层纸素A、 汉黄芩苷、 葛根素、 五味子乙素、 大豆 苷元、 汉黄芩素、 异阿魏酸、 欧前胡素 的标准品以甲醇为溶剂进行等摩尔比例混合， 配置成 浓度为10 μM混标 溶液， 过0.2 2 μm滤膜； 2） 将混标溶液用多室电泳筛选技术， 通过LC ‑MS/MS MRM模式进行检测， 同时设置不添 加靶蛋白的小分子自身电泳组与待测组进行对照， 筛选出3种 与靶蛋白MyD88蛋白结合的成 分； 3） 使用高效液相色谱联用质谱仪， 根据筛选出的3种与靶蛋白MyD88结合成分的MRM信 息， 进一步定性这3种潜在活性成分 分别为黄 芩苷、 汉黄 芩苷和汉黄 芩素； 4） 通过定量分析， 确定 黄芩苷、 汉黄 芩苷和汉黄 芩素与靶蛋白MyD 88结合的摩尔比例。 4.根据权利要求3所述的筛选结合MyD88的抗炎活性成分组合物的方法， 其特征在于： 步骤2） 所述的多室电泳筛选技术， 参数为所述千 金文武汤9种入 血原型成分与M yD88蛋白于 37℃水浴中孵化30min、 用pH  6.21的10  mM的乙酸铵作缓冲液， 缓冲液流速为4.0mL/min、 电 泳时间为20mi n。 5.根据权利要求4所述的筛选结合MyD88的抗炎活性成分组合物的方法， 其特征在于： 所述的高效液相色谱条件为： Tnature  C18反向色谱柱 （4.6  mm×150 mm、 5 μm） ， 流动相A为 0.1%甲酸水溶液， 流动相B为乙腈。 流速为0.5  mL·min‑1； 进样量为5  μL； 波长280  nm； 柱温 30℃； 梯度洗脱流 程如表所示。 6.根据权利要求5所述的筛选结合MyD88的抗炎活性成分组合物的方法， 其特征在于， 所述质谱条件为： 离子源为电喷雾离子源(  ESI)； 毛细管电压4.0  kV; 雾化气压力15psi;   去溶剂气温度300℃  ; 去溶剂气N2， 流速: 6 L·min‑1， 离子化模 式: 正负离子化模 式， 碰 撞电压在 13～24 V， 扫描方式为多反应监测模式。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115267205 A 2结合MyD88的抗炎活性成分组合物及筛选方 法 技术领域 [0001]本发明属于生物医药技术领域， 具体涉及结合MyD88的抗炎活性成分组合物及筛 选方法。 背景技术 [0002]糖尿病肾病(Diabetic  nephropathy， DN)是一种主要由糖尿病引发的肾小球病变 引起的肾脏疾病， 是糖尿病患者最严重的并发症之一。 糖尿病肾病的发病来源较为广泛， 其 中代谢紊乱、 遗传因素、 氧化应激和免疫炎症机制等因素被人们熟知。 患者体内糖代谢的稳 定被破坏， 使人体环境处在一种持续高糖的状态下， 大量有害的细胞因子和 生长因子在被 刺激后在机体内产生， 使 人体的肾小球内皮细胞被破坏， 肾小球的滤过功能发生障碍， 进而 造成人体肾小球与肾小管的纤维化和硬化。 持续性高脂血症会促进肾小球毛细血管凝血并 最终导致肾功能衰竭。 [0003]现在， 更为普遍的观点是糖尿病肾病的病因 以炎症反应为主， 并长期持续性处于 慢性微炎症状态。 因此， 在糖尿病肾病发病机制中着重研究免疫炎症机制， 在临床上对于寻 找新的药物治疗 靶点、 给予患者 新的治疗方案、 延缓糖尿病肾病的发生具有重要意 义。 [0004]早中期糖尿病肾病患者会采用饮食干预治疗、 降血糖、 降血压、 治疗蛋白尿等方式 减缓肾损伤。 在西药方面， 临床上常见的药物有 血管紧张素转化酶抑制剂、 血管紧张素 受体 拮抗剂等， 这些药物 不同程度地作用于肾脏， 降低糖尿病肾病相关炎症因子 （如NF ‑κB、 TNF‑ α、 IL‑6等） 的表达， 缓解患者蛋白尿症状， 进一步抑制糖尿病引起的肾脏损 害。 然而患者也 依旧会发生咳嗽、 低血压、 高血钾等不良反应。 因此现如今临床上常常选用中医药的方法来 治疗糖尿病肾病。 中医上治疗糖尿病肾病分为不同类型和 不同时期， 整体上按照本虚标实 来进行诊治， 针对不同时期不同类型的糖尿病肾病患者， 采取不同的治疗方式， 给予相应的 治疗药物， 如黄芪、 黄芩等益气 养阴、 降糖活血、 抗炎类中药， 均可以明显改善患者糖尿病肾 病的相关症状， 下调患者机体内炎症相关指标 的表达， 调节患者机体血糖水平并减缓患者 蛋白尿的症状。 而且中药成分较为复杂， 药理作用较为广泛， 近年来有 大量研究表明中药可 以通过作用于细胞内炎症反应因子(如TNF ‑α、 IL‑6、 MyD88等)来减轻糖尿病肾病患者的肾 脏炎症反应， 进而提升患者的治疗效果。 而对于终末期糖尿病肾病的患者来说， 肾脏功能已 经明显衰退， 体内的毒 素无法正常代谢及排泄， 很快便会出现尿毒症的症状， 此时临床上常 见的治疗方式就是肾脏的替代治疗， 主要包括血液透析、 腹膜透析及肾脏移 植。 现如今临床 上也常将中药治疗结合透析的方法来治疗糖尿病肾病患者， 这一方法可明显缓解患者的临 床症状， 下调患者机体内炎症相关指标的表达， 降低透析 频率， 减少并发症的发生。 [0005]千金文武汤是朝医学中治疗糖尿病肾病的重要组方之一， 其主要由山药、 黄芩、 葛 根、 藁本、 五味子、 白芷、 桔梗、 升麻、 麦门冬九味药材组成。 目前研究表明， 千金文武汤在临 床上常规治疗糖尿病肾病的基础上予以使用， 经四个疗程后， 治愈率可达九成以上； 且通过 动物模型实验研究证明， 糖尿病肾病大鼠在给予千金文武汤治疗后， 其尿量、 血糖、 肌酐清 除率等相关数值均有 所下降， 表明千金文武汤对糖尿病肾病大鼠的肾脏起到一定的保护作说　明　书 1/16 页 3 CN 115267205 A 3