(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210878974.4 (22)申请日 2022.07.25 (71)申请人 浙江工业大 学 地址 310014 浙江省杭州市拱 墅区潮王路 18号浙江工业大 学 (72)发明人 关荣发　杨梦雨　钟浩　刘晓凤　 刘东红　曹国洲　程勇　沈海涛　 黄俊　杨开　王衍彬　黄海智　 (74)专利代理 机构 杭州浙科专利事务所(普通 合伙) 33213 专利代理师 刘元慧 (51)Int.Cl. C12N 5/071(2010.01) C12N 5/0786(2010.01) C12Q 1/02(2006.01)C12Q 1/42(2006.01) G01N 27/04(2006.01) G01N 21/64(2006.01) G01N 30/02(2006.01) G01N 21/84(2006.01) G01N 21/31(2006.01) G01N 21/35(2014.01) G01N 33/68(2006.01) (54)发明名称 脂多糖诱导的Caco-2 /RAW264.7细胞共培养 模型的建立方法及应用 (57)摘要 本发明脂多糖诱导的Caco ‑2/RAW264.7细胞 共培养模型的建立方法及应用， 包括： 1） Caco ‑2 细胞和RAW2 64.7细胞的培养； 2） 将Caco ‑2细胞接 种于Transwell板上室的AP侧， 孵化； 3） RAW   264.7细胞接种于24孔板， 孵化； 4） 将Transwell 上室转移 到24孔板； 5） 将脂多糖 溶于PBS中， 配制 母液， 过滤后稀释备用； 6） 在BL侧加入LPS ‑10% DMEM培养基孵化， 形成肠道炎症模型。 本发明建 立了肠上皮细胞系Caco ‑2和巨噬细胞系RAW ‑ 264.7细胞的体外模型， 以建立肠 道炎症反应， 用 以研究巨噬细胞介导的Caco ‑2细胞对C3G纳米脂 质体的吸收机制。 权利要求书1页 说明书8页 附图8页 CN 115305230 A 2022.11.08 CN 115305230 A 1.脂多糖诱导的Caco ‑2/RAW264.7细 胞共培养模型的建立方法， 其特征在于， 该方法包 括以下步骤: 1） Caco‑2细胞在MEM培养基， RAW264.7细胞在DMEM培养基中分别进行细胞培养； 培养条 件为pH 7.4， 5%CO2， 37℃， 95%空气， 恒湿培 养21天， 培养基每隔1‑2天更换一次； 2） 将步骤1） 培养结束后的Caco ‑2细胞以1 ×105个/孔密度接种于24孔Transwell板上室 的AP侧， PC膜， 4 μm， 和步骤1） 相同的培 养条件下孵化21 天， 每24小时跟换一次培 养液； 3） RAW 264.7细胞以1 ×105个/孔的密度接种于24孔板， 和步骤1） 相同的培养条件下孵 化1天； 4） 将孵化21天的载有Caco ‑2细胞的Transwell上室转移到孵化1天的载有RAW264.7细 胞的24孔板， 此时AP侧为Caco ‑2细胞， BL侧为RAW264.7细胞； 5） 将脂多糖溶于PBS中， 配置成50μg/mL的母液， 过0.22 μm针孔式过滤器； 用10%DMEM培 养基稀释成1 μg/mL  LPS‑10%DMEM溶液； 6） 在BL侧加入 1 μg/mL的LPS ‑10%DMEM培养基孵化3h， 用ELISA试剂盒检测AP侧炎症因子 浓度， 形成肠道炎症模型。 2.如权利要求1所述的脂多糖诱导的Caco ‑2/RAW264.7细胞共培养模型的建立方法， 其 特征在于步骤1） 中MEM培养基中含有20%胎牛血清、 1%HEPES、 1%NEAA、 1%L ‑谷氨酰胺、 1%丙酮 酸钠、 100U/mL青霉素和10 0 mg/mL链霉素。 3.如权利要求1所述的脂多糖诱导的Caco ‑2/RAW264.7细胞共培养模型的建立方法， 其 特征在于步骤1） 中DMEM培养基中含有10%胎牛血清、 1%HEPES、 1%NEAA、 1%L ‑谷氨酰胺、 100U/ mL青霉素和10 0 mg/mL链霉素。 4.如权利要求1所述的脂多糖诱导的Caco ‑2/RAW264.7细胞共培养模型的建立方法， 其 特征在于步骤2） 中平均每三天检测一 次细胞的跨膜电阻值， 跨膜电阻值大于300Ωcm‑2 即 可视为单层致密完整。 5.如权利要求1所述的脂多糖诱导的Caco ‑2/RAW264.7细胞共培养模型的建立方法， 其 特征在于步骤2） 中平均7天检测一次碱性磷酸酶活性， 上室AP侧/下室BL侧比值越 大说明细 胞极化程度越高。 6.权利要求1 ‑5任一所述的脂多糖诱导的Caco ‑2/RAW264.7细胞共培养模型在研究其 对矢车菊素 ‑3‑葡萄糖苷纳米脂质体吸 收作用中的应用。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115305230 A 2脂多糖诱导 的Caco‑2/RAW264.7细胞 共培养模型的建立方 法 及应用 技术领域 [0001]本发明属于细胞培养技术领域， 具体涉及一种脂多糖诱导的Caco ‑2/RAW264.7细 胞共培养模型的建立方法及应用。 背景技术 [0002]矢车菊素 ‑3‑葡萄糖苷(cyanidin ‑3‑glucoside， C3G)是自然界分布最广的花色 苷， 大量存在于黑米、 黑豆、 紫甘蓝、 紫薯、 黑接骨木、 黑莓、 黑葡萄、 黑树莓、 血橙、 桑葚等有 色谷物、 水果和蔬菜中。 大量研究表明， C3G具有抗炎、 抗氧化、 抗癌、 预防心血管疾病、 调节 脂肪代谢的作用， 但C3G进入体内后极容易降解， 真正进入血液循环的大部分为其代谢产 物。 因此， 了解C 3G在体内的吸 收代谢以及代谢产物的生理功能对其有重要意 义。 [0003]纳米脂质体(nanoliposomes)在包埋物质后， 使被包埋物质的稳定性增加， 且易被 细胞吸收， 同时在机体内具有缓释作用。 纳米脂质体可以同时包埋亲水和亲脂性药物， 因此 作为一种有效的物质载体， 具有广阔的应用前景， 常被用来包埋特殊药物， 可以作为抗癌药 物的载体系统进而对药物进行靶向输送。 进而到达肿瘤部位进行靶向打击， 大大提高了药 物的利用效率。 [0004]肠屏障对健康至关重要， 是体内代谢最动态的系统之一， 其上皮单分子层的完整 性对于维持宿主的动态平衡至关重要， 根据目前研究表明， 完全分化的Caco ‑2细胞表现出 比其他结肠癌细胞系更好的形态和功能， 形成与小肠上皮细胞相同的细胞极性和致密的单 细胞层组织， 因此Caco ‑2细胞系可作为一个良好的细胞模型用于研究药物的吸收。 现已有 研究证明， C3G纳米脂质体在Caco ‑2细胞中的生物利用率大于C3G单体在Caco ‑2中的生物利 用率， 并且表明花色苷纳米脂质体进入细胞主 要依赖于大胞饮和clathri n介导的内吞。 [0005]“肠漏”意味着较高的肠上皮通透性， 可导致病原体、 内毒素、 抗原和促炎细胞因子 从胃肠道流入血流和淋巴系统。 所以炎症在肠道粘膜中起着系统性的作用。 因此， 通透性肠 道和炎症反应之间的联系 是双向的。 在炎症性肠病中观察到肠上皮屏障的破坏， 与氧化物 的过度产生有关， 肠细胞和免疫细胞释放的促炎信号， 通过持续和加重的炎症导致严重的 粘膜损伤。 肠屏障对健康至 关重要， 是体内代谢最动态的系统之一， 其上皮单分子层的完整 性对于维持宿 主的动态平衡至关重要， 因为它 抑制了管腔抗原的入侵。 因此， 建立一种位于 Transwell板顶孔的肠上皮细胞系Caco ‑2和位于基底外侧孔的巨噬细胞系RAW ‑264.7细胞 的体外模 型， 以建立肠道炎症反应， 用来研究巨噬细胞介导的Caco ‑2细胞对C3G纳米脂质体 的吸收机制十分有必要。 发明内容 [0006]针对现有技术中存在的本体， 本发明设计的目的在于提供一种脂多糖诱导的 Caco‑2/RAW264.7细胞共培养模型的建立方法， 构建 “炎症反应— 吸收规律—分子响应 ”的 数据网络， 阐明矢车菊素 ‑3‑葡萄糖苷在共培 养体系中的吸 收机制。说　明　书 1/8 页 3 CN 115305230 A 3