ICS 65.020.30 B 40 DB33 浙 江 省 地 方 标 准 DB33/T 2183—2019 家蚕核型多角体病抗性鉴定方法 Regulation of identification for silkworm nuclear polyhedrosis resistance 2019-02-15 实施 2019-01-15 发布 浙江省市场监督管理局 发 布 DB33/T 2183-2019 前 言 本标准按照 GB/T 1.1-2009 给出的规则起草。 本标准由浙江省农业农村厅提出。 本标准由浙江省种植业标准化技术委员会归口。 本标准起草单位：浙江大学蚕蜂研究所、浙江大学农业技术推广中心、浙江省农业技术推广中心、 浙江省蚕种质量检验检疫站、浙江省农业科学院蚕桑研究所、桐乡市蚕业有限公司、浙江省种植业管理 局。 本部分主要起草人：鲁兴萌、周金钱、邵勇奇、楼霞、赵新华、谷利群、王永强、徐杰、张三妹、 黄衍峰。 I DB33/T 2183-2019 家蚕核型多角体病抗性鉴定方法 1 范围 本标准规定了家蚕核型多角体病抗性鉴定的术语和定义，家蚕核型病毒多角体试验用悬浮液的制备、 计数及保存，半数致死浓度测定，抗性鉴定评价。 本标准适用于家蚕一代杂交种的核型多角体病抗性评价。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 8170 数值修约规则与极限数值的表示和判定 DB33/T 2019 蚕种生产技术规程 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本标准。 3.1 家蚕核型多角体病病毒 bombyx mori nuclear polyhedrosis virus 为杆状病毒科、真杆状病毒亚科、核型多角体病毒属的一种。 3.2 家蚕核型多角体病病毒多角体 bombyx mori nuclear polyhedrosis virus and inclusion body 家蚕核型多角体病病毒在家蚕体内繁殖后，形成包埋了大量病毒的多角体，在生物光学显微镜下呈 六角形，并具有较强折光性。 3.3 家蚕核型多角体病 silkworm nuclear polyhedrosis 核型多角体病病毒在家蚕体内大量繁殖，蚕体呈乳白色、体躯肿胀、狂躁爬行、体壁易破典型病征， 或致死的病害。 1 DB33/T 2183-2019 3.4 半数致死浓度 median lethal concentration（LC50） 在规定时间内，通过添食攻毒感染，使 2 龄家蚕半数死亡所需的病毒多角体浓度。 3.5 攻毒 challenge test 以人工添毒的方法，将病毒多角体悬浮液均匀涂抹于桑叶背面，喂饲家蚕使之感染。 3.6 抗性指数 resistance index 用于衡量参试蚕品种抗性的指数，以参照品种 LC50 平均值为 100R。 4 家蚕饲养 按DB33/T 2019中简化催青的要求催青，常规饲养至2龄起蚕。 5 家蚕核型病毒多角体试验用悬浮液的制备、计数及保存 5.1 悬浮液的制备 5.1.1 添食 6 将纯化的病毒多角体，用蒸馏水配成1×10 个/毫升浓度的攻毒液。取3 片大小约10 cm×10 cm清洁 桑叶，用脱脂小棉球蘸取5 ml，均匀涂抹在每片桑叶背面，喂饲100头4龄起蚕，基本食净后(约12 h)， 改用清洁桑叶喂饲。在24℃～25℃的温度下，饲养7 d～10 d备用。 5.1.2 制备 从饲养的攻毒蚕中，选择有体色乳白和体躯肿胀典型病征，但尚未出现狂躁爬行病症和皮破之前， 用剪刀从病蚕的腹足或尾角收集其体液，经2层脱脂纱布过滤，然后将滤液用3000 r/min离心10 min， 弃上清；沉淀用无菌生理盐水充分悬浮后，再用3000 r/min离心10 min，弃上清；重复离心3 次～5次， 至沉淀呈较为均质的乳白色，再用少量无菌生理盐水充分悬浮，即成病毒多角体悬浮液。 5.2 病毒多角体的计数 9 用血球计数板计数病毒多角体悬浮液中多角体的数量，并用无菌生理盐水调成1×10 个/毫升的病毒 多角体悬浮液母液，直接使用或置4℃冰箱内备用。 5.3 病毒多角体悬浮液的保存 5.3.1 保存方法 2 DB33/T 2183-2019 将病毒多角体悬浮液置4℃保存。 5.3.2 保存时间 病毒多角体悬浮的有效保存时间为≤2年。 6 半数致死浓度测定 6.1 攻毒用多角体悬浮液的配制 9 9 8 将病毒多角体悬浮液母液（1×10 个/毫升）用无菌生理盐水稀释成1×10 个/毫升、1×10 个/毫升、 7 6 5 1×10 个/毫升、1×10 个/毫升和1×10 个/毫升的稀释病毒多角体悬浮液。也可采用类似的其它10倍梯度 方法制作稀释病毒多角体悬浮液。病毒多角体悬浮液母液及梯度稀释液的有效保存时间为≤1 个月。 6.2 攻毒对象和设区 6.2.1 攻毒对象 测试蚕品种、对照蚕品种的 2 龄起蚕。 6.2.2 攻毒设区 设5个10倍稀释浓度病毒多角体悬浮液，每个浓度设3个重复区，每个重复区30头蚕。同时设无菌生 理盐水添食作对照区。 6.3 攻毒添食与饲养 取1片清洁适龄桑叶，切成约5cm×5cm的方块叶，用小脱脂棉球将200 μL的病毒多角体悬浮液均匀 涂抹在方块叶背面后喂食。待桑叶基本食净（约12 h）后，改饲清洁桑叶，在25℃～ 27 ℃的温度下饲 养。 6.4 病死蚕计数 6.4.1 校验 对照区有非核型病毒多角体病因素引起的异常，试验重做。 6.4.2 病死蚕统计 从2 龄起蚕攻毒开始到2 眠眠起止，为病死蚕计数时间。有核型病毒多角体病典型病征的蚕，计为 病死蚕；没有典型病征的3龄起蚕，计为健康蚕。对不能确定的迟眠蚕，取其血用显微镜检查，检到有 家蚕核型病毒多角体的，计入病死蚕。计算各浓度区的死亡率和平均死亡率。 6.5 半数致死浓度的计算 半数致死浓度（LC50）的计算，采用Reed-Muench法。 ………………..(1) 式中： 3 DB33/T 2183-2019 LC50——半数致死浓度； DU50——死亡率超过50%试验组的累计死亡率； DD50——死亡率低于50%试验组的累计死亡率； logN——稀释因子的对数； DU50-log——累计死亡率超过50%试验组的病毒多角体悬浮液浓度对数。 7 抗性鉴定评价 7.1 抗性参照蚕品种 抗性参照蚕品种设2个，菁松×皓月(正反交)、秋丰×白玉(正反交)。参照品种与待鉴定评价品种同 步试验，按照本标准第6章计算LC50。 7.2 抗性指数 以2个参照蚕品种的LC50平均值为100R，再根据待测蚕品种的LC50换算出该品种的抗性指数。 7.2.1 参照蚕品种的半数致死浓度平均值 CKLC50  CK1LC50  CK 2 LC50  CK 3LC50  CK 4 LC50  100 R ............... (2) 4 式中： CKLC50——参照品种的半数致死浓度平均值； CK1LC50、CK2LC50、CK3LC50、CK4LC50——2个对照品种（正反交）的半数致死浓度； 100R——对照种抗性指数。 7.2.2 待测蚕品种的抗性指数 TGI  TGLC50  100 R ................................. (3) CKLC50 式中： TGI——待测蚕品种的抗性指数； TGLC50——待测蚕品种的半数致死浓度； CKLC50——对照品种的半数致死浓度平均值。 7.3 抗性等级评级 按照表1对家蚕品种的核型多角体病毒抗性等级作出鉴定评价。 表 1 家蚕对核型多角体病毒的抗性等级 核型多角体病抗性等级 超强 (Ultrastrong) 强 (Strong) 一般 (General) 弱 (Weak) 4 抗性指数 >1600R 201R ～ 1600R 50R ～ 200R ＜50R 应用建议 可在家蚕核型多角体病流行严重的蚕区饲养 可在家蚕核型多角体病流行较严重的蚕区饲养 可在非家蚕核型多角体病流行的蚕区饲养 慎用 DB33/T 2183-2019 8 数据修约 按GB/T 8170要求，保留2位小数。 _________________________________ 5