(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202111675554.8 (22)申请日 2021.12.31 (71)申请人 郑州大学第一附属医院 地址 450052 河南省郑州市 建设东路50号 (72)发明人 秦志海　刘洋洋　盛誉乔　李峰　 薛瑞　段茜茜　 (74)专利代理 机构 广东君龙律师事务所 4 4470 专利代理师 金永刚 (51)Int.Cl. C12Q 1/02(2006.01) A61K 39/395(2006.01) A61K 31/502(2006.01) A61P 35/00(2006.01) (54)发明名称 一种抗乳 腺癌肿瘤药物联用方法、 体外和体 内验证方法 (57)摘要 本发明公开了一种抗乳腺癌肿瘤药物联用 方法、 体外和体内验证方法。 具体涉及奥拉帕尼 联合CD47中和抗体在抗乳腺癌肿瘤中的应用， 主 要解决目前奥拉帕尼在非BRCA突变乳腺癌肿瘤 中联合用药较少的技术问题。 本发 明通过奥拉帕 尼联合CD47中和抗体的抗乳腺癌肿瘤活性试验， 显示较好的抗乳腺癌肿瘤活性， 提出新的肿瘤联 合治疗方法。 权利要求书1页 说明书7页 附图10页 CN 115305272 A 2022.11.08 CN 115305272 A 1.一种抗乳腺癌肿瘤药物联用体外验证方法， 其特征在于， 用奥拉帕尼处理已经敲低 CD47表达的乳腺癌细胞E 0771， 验证与之共培 养的巨噬细胞 吞噬肿瘤 细胞的能力， 包括： (1)取小鼠骨髓 单核细胞， 用包含有浓度为20ng/ml的C ‑MSF、 10％胎牛血清、 100unit s/ ml青霉素以及100units/ml链霉素的DMEM培养基中培养5天， 换成包含有浓度为20ng/ml的 C‑MSF、 10％胎 牛血清、 100units/ml青霉素以及100units/ml链霉素的乳腺癌细胞E0771上 清进行培 养48小时， 诱 导为肿瘤相关巨噬细胞TAM； (2)将带绿色荧光蛋白的sh  Scramble  E0771细胞、 sh  CD47E0771细胞与TAM共孵育， 分 为四组， shSramble  E0771+TAM+saline组、 shCD47  E0771+TAM+saline组、 shSramble  E0771 +TAM+Olaparib组、 sh CD47 E0771+TAM+Olaparib组； (3)向以上四组同时加入奥拉帕尼2.5uM或者saline,37 °共孵育1小时， 再用F4/80标记 巨噬细胞， 流式检测F4/80+GFP+来表示巨噬细胞 吞噬肿瘤 细胞的效率； (4)流式检测发现sh CD47 E0771+TAM+Olaparib组F4/80+GFP+的细胞 数量最多。 2.根据权利要求1所述的抗乳腺癌肿瘤药物联用体外验证方法， 其特征在于， 敲低CD47 表达的乳腺癌细胞E 0771的方法包括： 第一步， 用完全培养基对小鼠乳腺癌细胞E0771制备第一密度的细胞悬液， 然后从中定 量取出， 分别移入到孔板中的多个容纳孔中， 继续培 养第一时长； 第二步， 取出低温环境保存的小鼠CD47  shRNA病毒， 冰上进行缓慢融化； 用完全培养基 将所述小鼠CD47  shRNA病毒稀释至少三种不同的滴度， 且每种滴度的容 量均为第一 容量； 第三步， 向所述容纳孔中加入经过稀释后的小鼠CD47  shRNA病毒液， 感染后8 ‑12h， 再 向每个容纳孔中加入10 0ul完全培 养基， 保持细胞正常生长； 第四步， 继续培 养2‑3天， 期间补充营养基， 保持细胞活性； 第五步， 感染效果确认， 感染后72小时， 荧光表达丰度较高时， 用显微镜观察， 当感染效 率在80％， 且细胞生长良好的组继续扩大培养， 扩大培养后进行流式细胞分选， 分选出GDP 阳性的细胞， 即转染成功的细胞。 3.一种抗乳腺癌肿瘤药物联用体内验证方法， 其特征在于， 奥拉帕尼联合中和抗体 Anti‑CD47 IgG对小鼠体内肿瘤生长抑制进行验证， 包括： (1)分别给小鼠接种LUC+GFP  E0771细胞， 分为四组， Isotype处理组、 Anti ‑CD47 IgG处 理组、 奥拉帕尼联合 Isotype处 理组、 奥拉帕尼联合Anti ‑CD47 IgG处理组； (2)从接种肿瘤细胞第7天给予奥拉帕尼， 50mg/kg/day， 腹腔注射， 接种第10天和第20 天， 给予Isotype或者Anti ‑CD47 IgG， 50ug/只， 瘤内注射； (3)开始给 药后每隔7天进行小动物活体成像， 隔天测量肿瘤体积及小鼠体重； (4)对小鼠肿瘤体积进行隔天测量， 奥拉帕尼 联合Anti ‑CD47IgG处理组肿瘤体积明显 小于单独使用奥拉帕尼处 理组， 肿瘤体积更小。 4.一种抗乳腺癌肿瘤药物联用方法， 其特征在于， 将奥拉帕尼联合CD47中和抗体用于 抗乳腺癌肿瘤治疗。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115305272 A 2一种抗乳腺癌肿瘤药物联用方 法、 体外和体 内验证方 法 技术领域 [0001]本发明涉及抗肿瘤治疗领域， 尤其涉及一种抗乳腺癌肿瘤药物联用方法、 体外和 体内验证方法。 背景技术 [0002]肿瘤的治疗一直被全世界所密切 关注。 由于肿瘤早期具有转移的能力， 肿瘤细胞 生长快、 易变异， 从而对常规化疗药物， 尤其是单药化疗产生 耐药， 导致化疗失败， 因此仍需 要研究开发新型抗肿瘤药物以满足临床治疗的需求。 [0003]肿瘤巨噬细胞是乳腺肿瘤中肿瘤浸润性白细胞的主要群体之一， 巨噬细胞是一种 异质性的细胞群， 常分为M2样(促肿 瘤表型)和 M1样(抗肿 瘤表型)巨噬细胞。 巨噬细胞具有 很强的吞噬能力。 M1巨噬细胞常产生 促炎细胞因子， 吞噬微 生物， 并启动免疫反应。 [0004]“自我标记 ”膜蛋白CD47通常在肿瘤细胞上高表达， 并与巨噬细胞上的 “信号调节 蛋白”SIRP‑a结合抑制巨噬细胞的吞噬功能， 进而协助肿瘤细胞免疫逃逸。 靶向CD47是癌症 免疫治疗的一种新策略， 抗CD47  IgG倾向于 激活巨噬细胞的吞噬作用。 [0005]PARP抑制剂选择性地诱导具有同源重组缺陷(HRD)的癌症细胞进入凋亡， 最显著 的是BRCA1和BRCA 2基因突变的癌症细胞。 [0006]然而， 最近的临床证据表明， 无论BRCA1/2或HRD状态如何， PARP抑制剂作为癌症治 疗药物都是有效的， 这表明更广泛的患者群 体可能受益于PARP抑制剂治疗。 [0007]目前， 四种PARP抑制剂已获美国食品和药物 管理局(FDA)批准， 用于治疗BRCA突变 的晚期卵巢癌和乳腺癌。 [0008]尽管已经证明PARP抑制剂可以提高无进展生存期， 但癌细胞不可避免地会产生耐 药性。 为了克服对PARP抑制剂的耐药性， 优先考虑PARP抑制剂与激活免疫反应的药物进行 联用。 [0009]PAPR抑制剂与新型癌症疗法的组合使用仍是一个创新领域。 联合治疗已成为癌症 治疗的一个重要发展方向， 亟 待新的联合治疗方案来更有效的对抗各种癌症。 发明内容 [0010]本发明主要解决的技术问题是提供一种抗乳腺癌肿瘤药物联用方法、 体外和体内 验证方法， 解决现有技术中奥拉帕尼在非BRCA突变乳腺癌肿瘤中联合用药较少的技术问 题。 [0011]为解决上述技术问题， 本发明采用的一个技术方案是提供一种抗乳腺癌肿瘤药物 联用体外验证方法， 用奥拉帕尼处理已经敲低CD47表达的乳 腺癌肿瘤细胞E0771， 验证与之 共培养的巨噬细胞 吞噬肿瘤 细胞的能力， 包括： [0012](1)取小鼠骨髓单核细胞， 用包含有浓度为20ng/ml的C ‑MSF、 10％胎牛血清、 100units/ml青霉素以及100units/ml链霉素的DMEM培养基中培养5天， 换成包含有浓度为 20ng/ml的C ‑MSF、 10％胎牛血清、 100units/ml青霉素以及100units/ml链霉素的乳腺癌肿说　明　书 1/7 页 3 CN 115305272 A 3